食品中γ-谷氨酰肽的研究进展

辛世华，韩小珍，贺晓光*

（1.宁夏工商职业技术学院旅游管理系，宁夏银川 750021；2.宁夏大学学术期刊中心，宁夏银川 750021；3.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021）

“民以食为天，食以安为本，食以味为先”的中国传统饮食理念涵盖了食物的三大属性（基本属性、生理属性和修饰属性），滋味是主要的修饰属性，也是食物的基本特征[1]。滋味是由食物中的氨基酸、糖类、肽类等一些亲水性的小分子或离子溶于唾液并刺激口腔内特定的味觉受体，通过神经传导最终产生味感[2]。酸、甜、苦、咸、鲜是人们广泛熟知的五种基本滋味[3]，厚味（kokumi）是继酸、甜、苦、咸、鲜之后的第6种滋味，主要代表食物的浓厚感（thickness）、持续性（continuity）、饱满感（mouthfulness）和协调性（har mony of taste）。Kokumi物质的特点是，当添加到基本的味道溶液或食物中，它能够提升5种基本口味的协调性和呈味强度（尤其是鲜味），使食品产生整体味感、增加味的持续性和延渗性[4-5]。目前已报道的kokumi物质多数为短肽类，其中γ-谷氨酰肽是厚味的主要贡献者，所以，γ-谷氨酰肽也称为γ-kokumi肽[6]。γ-谷氨酰肽凭借其良好的味觉特性，不仅影响食品的营养和感官评价，还能与糖、核苷酸等呈味分子组合使用提升鲜味强度并增强浓厚味，所以γ-谷氨酰肽具有极大的开发价值和市场前景[7]。

随着研究的深入，γ-谷氨酰肽参与人体生理活性的机制以及呈味机制逐渐明晰，在医疗领域和食品领域具有巨大的潜力，已成为近年来国内外的食品鲜味科学的研究热点。基于此，本文对γ-谷氨酰肽的结构特征、呈味机制、制备方法及检测方法进行了综述，旨在为γ-谷氨酰肽的深入研究和新型鲜味剂的开发提供理论参考。

1 γ-谷氨酰肽的结构特征

γ-谷氨酰肽广泛分布于自然界中[8]。γ-谷氨酰肽是由谷氨酸的γ-COO-与γ-谷氨酰基受体（R基团）的NH3+脱水缩合而成，其中R基团可以为多肽或者游离氨基酸。研究发现，γ-谷氨酰肽分子质量大小和其特有的N末端的γ-谷氨酰基是其赋予食物浓厚味的关键因素[7，9]。具有Kokumi活性的γ-谷氨酰肽一般具有以下特征：①当γ-谷氨酰肽的分子质量低于1 000 Da时能够使食物产生浓厚、饱满感且连续性的口感[10]；②具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽类物质几乎都是二肽和三肽类物质；③γ-谷氨酰肽的氨基酸组成也会明显影响其呈味效果，C-末端残基、中间残基和含硫基团对其浓厚味具有重要影响[11]。当C-末端残基为无侧链的甘氨酸（glycine，Gly）时，可进一步增强γ-谷氨酰肽的浓厚味活性[12]；当其第2个残基处为L-构型的中小型脂肪族、中性或非极性取代基时，γ-谷氨酰肽与受体的结合增强，呈味活性提高[13]；进一步的，γ-谷氨酰肽残基侧链中有含硫基团（-SH）时，浓厚味强度会增强，原因是-SH在舌尖上产生的轻微收敛感引起的[13]；④研究发现，部分kokumi肽中存在如缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸等疏水性苦味氨基酸时，γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应不仅能够降低这些苦味氨基酸带来的苦味强度，还能产生更加饱满、丰富的kokumi风味[5，14]。

2 γ-谷氨酰肽的呈味机制

国内外关于γ-谷氨酰肽的呈味机理及其风味特点的描述逐渐趋同，即当其溶于水溶液时基本没有味道或味道很淡，当添加到含有基本味觉物质的食品体系中时，他们能够与食品中的基本味觉物质相互协同增效，使得食物的咸鲜味明显增加，赋予食品明显的厚味或者增强的厚味，同时，此类γ-谷氨酰肽在水溶液中的呈味阈值明显高于食品体系中的阈值[15]。

2.1 γ-谷氨酰肽的呈味机理

关于5种滋味（酸、甜、苦、咸、鲜）的特异性受体早有报道[16]。对于厚味γ-kokumi肽的受体研究报道稍晚一些，而对厚味味觉受体的发现是厚味研究的突破性进展。2009年，SAN G A等[17]发现小鼠的味感细胞中存在钙离子敏感受体（calcium-sensing receptor，CaSR），并首次证实了CaSR是引起哺乳动物浓厚味感的潜在味觉组织。2010年，OHSU T等[18]将钙离子敏感受体在卵母细胞和HEK-293细胞中成功表达，并发现γ-谷氨酰肽的厚味特性与其对钙离子敏感受体的激活强度呈正相关关系；随后KURODA M等[8]的研究不仅证实了这一点，还证实了CaSR参与了γ-谷氨酰肽的呈味反应，因为当他们向反应液中加入CaSR特异性拮抗剂NPS-2143后，γ-谷氨酰肽的味觉强度显著降低。因此，γ-谷氨酰肽厚味与CaSR之间存在较好的关联性。AMINO Y等[10]测试了100种已知氨基酸序列的γ-谷氨酰二肽和三肽对CaSR的激活作用，发现N端为γ-谷氨酰残基，中间连接中等大小、脂肪族、中性取代基的γ-谷氨酰二肽或者三肽不仅具有厚味，还具有很强的激活钙离子敏感受体的能力，证明了γ-谷氨酰肽的呈味机理，即钙离子敏感受体是浓厚味产生的重要原因。

2.2 γ-谷氨酰肽对钙离子敏感受体的变构调节作用

钙离子敏感受体（CaSR）是一种存在于细胞膜表面的细胞表面蛋白，能够在细胞和组织中表达，如味觉细胞、骨、肾脏、甲状旁腺、小肠等[19]。CaSR具有促进细胞生长、繁殖以及刺激胃肠激素分泌和肠道蠕动等功能[20]。CaSR由1 078个氨基酸残基组成，属于典型的G蛋白偶联受体（Gprotein coupled receptors，GPCR）C家族的第二组成员[21]。CaSR可分为3个独立的区域，包括细胞内结构域、细胞外结构域和跨膜结构域。其中，细胞外结构域主要包含了二裂片状的捕虫夹（venus-flytrap，VFTD）结构域，能够结合多种识别配体以激活CaSR，进而启动下游信号通路，实现调节细胞生理活动的功能[11-22]。CaSR胞外氨基（-NH2）末端结构域是配体结合区[23]。胞内结构域约含有5个蛋白激酶C和2个蛋白激酶A的磷酸化作用位点[24]。跨膜结构域中的2个半胱氨酸残基（cysteine 677和765）对维持CaSR构象很关键，次结构域包含Ca2+结合位点[23-24]。

每个味蕾由50～150个特殊味觉受体细胞（taste receptor cell，TRC）组成，TRC则分为4种类型：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ型（见图1）[11]，其中接收鲜、甜、苦味的GPCR受体在Ⅱ型TRC通路中，甜味受体是异二聚体T1R2/T1R3，苦味受体为T2Rs受体家族，鲜味受体是异二聚体T1R1/T1R3[23]；而CaSR在Ⅱ、Ⅲ型TRC中都有表达，且主要在Ⅲ型中表达[25]。相同的是Ⅱ和Ⅲ型都是首先通过CaSR激活的信号通路以增强Ca2+的释放。如厚味物质（谷胱甘肽，谷氨酸）结合特异性受体CaSR通过磷脂酶（phospholipase，PLC）依赖性途径提高胞内Ca2+浓度[26]。不同的是Ⅱ型TRC通路增强Ca2+的释放，进而提高细胞动作电位并加强ATP的释放，从而增强厚味；而Ⅲ型TRC中胞内Ca2+浓度的增加与神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的释放有关，5-HT通过对Ⅱ型TRC有负反馈调节，会抑制其三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的释放，但5-HT是否以CaSR依赖性方式释放目前尚不清楚。同时CaSR在Ⅱ、Ⅲ型TRC中都能表达，但具体它们之间的信号传导是否有叠加效应，能否增强滋味的浓厚感还有待研究。

图1 CaSR在味觉细胞中的信号传导途径[11]Fig. 1 Signal transmission pathway of CaSR in taste cells[11]

3 γ-谷氨酰肽的制备

由于γ-谷氨酰肽独特的呈味特点和增味功能，含有γ-谷氨酰肽的食用调味品生产日益受到人们关注，因为γ-kokumi肽大规模生产能力较低，目前市场上γ-kokumi肽类食物增味剂非常少，仅有谷胱甘肽（glutathione，GSH）或富含GSH的酵母提取物[27]。目前自然提取法、化学合成法和生物合成法是制备γ-谷氨酰肽的主要方法，其中生物合成法又分为微生物发酵法和酶合成法[10]。

3.1 自然提取法

自然提取法主要应用于谷胱甘肽和茶氨酸的提取。因为这两种物质是人们最早发现具有独特呈味特性的γ-谷氨酰肽。但由于提取工序繁琐且需要使用有机试剂，不适用于工业化生产而逐渐被淘汰[28]。

3.2 化学合成法

化学合成法是以产物氨基酸为原料，经过肽键缩合等化学反应来合成γ-谷氨酰肽的方法。化学合成法多用于纯度要求极高的γ-谷氨酰肽的制备，且主要集中在二肽和三肽的合成，如谷胱甘肽。其特点是纯度高、稳定性好，是许多试剂公司制备γ-谷氨酰肽的首选方法。如HAMMERL R等[29]学者以树脂为原料，在实验室成功制备出纯度99%的γ-Glu-Thr，γ-Glu-Asp和γ-Glu-Lys。但化学合成法通过对活性基团进行保护或者屏蔽，在制备过程中需要使用过量的偶联剂和酰化试剂，存在操作繁琐、反应复杂，成本高，产率低，化学物毒性等问题，其产物主要应用于实验室的分析检测，不适用于γ-谷氨酰肽的工业化水平大规模生产[10，14，30]。

3.3 微生物发酵法

微生物发酵法是利用特定微生物代谢活动产生的多种酶类，将廉价的原料在特定的培养环境下催化为γ-谷氨酰肽的方法。代表性的如谷胱甘肽（GSH）是利用酵母菌发酵实现产业化生产的γ-谷氨酰肽[31]。VALERIO F等[32]利用植物乳杆菌发酵产品制备低盐酵母发酵法面包，将植物乳杆菌发酵产物（Bio21B）作为增味剂应用于面包发酵过程，得到了含盐量降低20%和50%的酵母发酵法面包，同时含Bio21B的酵母发酵面包增加了几种鲜味和厚味γ-谷氨酰肽味道相关分子的存在。SOFYANOVICH O A等[33]证明酿酒酵母通过2种代谢途径合成了γ-Glu-Val-Gly。PHEWPAN A等[34]从泰国淡水鱼发酵样品检测出了以四球菌、葡萄球菌、乳酸菌为主的4种细菌，并发现了17种谷氨酰肽。研究表明，发酵食品中的微生物代谢活动与γ-谷氨酰肽的形成有密切的关系。

利用微生物发酵法生产γ-谷氨酰肽的原料来源广泛，成本较低，适合工业化生产，具有良好的前景。然而存在的问题也较突出，如常见的发酵食品都是传统的固态发酵，用料成分复杂，微生物细胞内的酶体系复杂，无法获得单一的目标γ-谷氨酰肽，分离纯化具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽较困难，其次发酵菌株和工艺流程需要优化以提高产率。所以微生物发酵法生产γ-谷氨酰肽存在时间久、产能低效、提纯难、产业化难度较高等问题。

3.4 酶合成法

酶合成法是特定酶在适宜条件下将底物催化合成γ-谷氨酰肽的方法。γ-谷氨酰肽在生物体内的代谢合成途径见图2。γ-谷氨酰肽参与生物体的多种生命活动，可由谷胱甘肽合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、γ-谷氨酰环化转移酶和γ-谷氨酰转肽酶等催化合成。目前文献报道的具有合成γ-谷氨酰肽能力的酶制剂主要有：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase，CSASE）、谷氨酰胺酶（glutaminase）EC3.5.1.2和γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GGT）。谷氨酰半胱氨酸合成酶催化合成γ-谷氨酰肽多见于动物体，反应需要消耗ATP，酶活力受到ADP和产物的反馈抑制，需要连续的能量供应才能实现工业化生产[35]。下面重点介绍下合成γ-谷氨酰肽最常用谷氨酰胺酶（glutaminase）EC3.5.1.2和γ-GGT。

图2 γ-谷氨酰肽的生物合成途径Fig. 2 Biosynthetic pathway of γ-glutamyl peptides

3.4.1 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶广泛存在于细菌、真菌和酵母菌等微生物中[36-37]。不同来源的谷氨酰胺酶专一性不同，根据底物的特异性将其分为两大类，一类仅能以谷氨酰胺为底物水解为谷氨酸；另一类谷氨酰胺和天冬酰胺均可作为底物，在催化谷氨酰胺水解为谷氨酸的同时也可以催化天冬酰胺水解为天冬氨酸。除了水解活性，部分来源的谷氨酰胺酶也具有转肽活性，如硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens）源的谷氨酰胺酶，可催化谷氨酰胺中的γ-谷氨酰部分转移到甲基或者乙基上，进而合成了茶氨酸[35]。

在工业生产中，谷氨酰胺酶主要应用于酱油发酵，能够将酱油发酵过程中产生的谷氨酰胺水解为具有鲜味的谷氨酸。YANG J等[36]将解淀粉芽孢杆菌源的谷氨酰胺酶转肽合成的γ-谷氨酰肽（γ-[Glu]（n≤5）-Phe/Val/Met）添加到鸡汤和酱油中，能够增加鸡汤和酱油的kokumi味；并且YANG J等[30]将其添加腐乳发酵过程中，不仅成功消除了腐乳表面的白色颗粒（酪氨酸和苯丙氨酸），其合成的γ-谷氨酰肽还改善了腐乳的kokumi风味。SUZUKI H等[38]的研究也证明了解淀粉芽孢杆菌源的谷氨酰胺酶能够显著增加谷蛋白和大豆蛋白水解产物的kokumi味。相信随着更多产谷氨酰胺酶的微生物的发现，也会有更多微生物源谷氨酰胺酶可用于催化γ-谷氨酰转肽反应进而合成γ-谷氨酰肽。

3.4.2γ-氨酰转肽酶

γ-谷氨酰转肽酶（γ-GGT）能够水解γ-谷氨酰基化合物并将其γ-谷氨酰基部分转移至氨基酸和肽上形成新的γ-谷氨酰肽，所以GGT属于转移酶而不是合成酶。GGT酶活力较高，对γ-谷氨酰基受体的特异性要求不高，反应不需要消耗能量，所以是目前用来制备γ-谷氨酰肽最常用的一种生物酶制剂，具有大规模生产γ-kokumi肽的应用前景[14]。

TOELSTEDE S等[39]研究指出，蓝色脉纹奶酪中的青霉菌通过γ-谷氨酰转肽酶合成了其具有浓厚味的γ-谷氨酰肽；VAN H T等[40]将枯草芽孢杆菌来源的GGT添加至发酵豆酱中，γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Val的浓度显著提高，使豆酱的鲜味和浓厚味增加，改善了豆酱的风味。

目前利用发酵法制备γ-谷氨酰肽的主要困难是需筛选出优良菌株，改进发酵工艺和发展分离纯化技术。已有大量学者将从地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或大肠杆菌（Escherichia coli）中分离纯化得到的GGT酶应用于γ-谷氨酰肽的生产[41]。运用谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶制备γ-谷氨酰肽的过程中，GGT相较于谷氨酰胺酶具有更加强大的转肽活性，而谷氨酰胺酶受体的底物特异性较差，γ-谷氨酰基转移活性较低，难以用于γ-kokumi肽的工业化生产。所以使用GGT生产γ-谷氨酰肽将为kokumi肽的食用调味品生产提供良好的发展前景。

4 γ-谷氨酰肽的检测

γ-谷氨酰肽的检测方法可分为感官评价法、生物学方法和化学法这3种方法[7]。感官评价法是根据γ-谷氨酰肽的呈味特性进行评定。生物检测法即钙敏感受体（CaSR）法是基于γ-谷氨酰肽能够结合特异性受体CaSR，激活信号通路释放Ca2+，进而激活细胞内源性依赖Ca2+的氯离子通道产生可检测性电流，通过测定电流响应值即可测得γ-谷氨酰肽的含量[42]。化学法是根据γ-谷氨酰肽的生物学特性，进而对其进行定性及定量分析。不同的方法各有利弊，对γ-谷氨酰肽检测方法的研究是目前γ-谷氨酰肽研究的重要部分，对于推动呈味肽的发展具有重要的意义。

4.1 感官评价法

γ-谷氨酰肽单独溶于水溶液时基本没有味道或味道很淡，当其添加到含有五种味觉体系（酸、甜、苦、咸、鲜味）或其混合味溶液的食品体系中时，能够与食品中的基本味觉物质相互协同增效，赋予食品明显的厚味或者增强浓厚感。依据这一特性，再借助人的味觉器官对食品体系进行描述，最后经统计学分析得出的最终感官评价结果即γ-谷氨酰肽的感官评价法[43]。MIYAKI T等[6]将微量的γ-Glu-Val-Gly添加至鸡汤中，通过感官评价法与对照组（未添加γ-Glu-Val-Gly）相比发现，在99%的置信水平上微量的γ-Glu-Val-Gly可以显著增加鸡汤的鲜味和满口感；MIYAMURA N等[44]将γ-Glu-Val-Gly添加到低脂花生酱，通过感官评价发现其显著增强低脂花生酱的浓厚感。感官评价法虽然能够快速对食物的风味作出判定但判定结果存在一定的主观性，同时由于kokumi味描述的复杂性，所以运用感官评价法判定kokumi风味存在一定的局限性，难以满足物质kokumi强度的定量检测。

4.2 生物检测法

γ-谷氨酰肽的生物检测法又称为钙敏感受体法，CaSR法，是基于kokumi肽可激活CaSR释放Ca2+流而启动一系列味觉信号传递，通过味觉系统使人体感知到食品体系的浓厚感、复杂感和持久感。CaSR法主要通过检测CaSR激动剂进而检测食品体系的浓厚感。CaSR激动剂是一种微小的有机分子物，对CaSR产生变构激活作用，从而降低受体活化的阈值，因而产生浓厚感[2]。日本学者OHSU T等[18]首次用钙敏感受体法（CaSR法）检测一系列合成的γ-谷氨酰肽的kokumi滋味，结合感官分析发现γ-谷氨酰肽包括GSH（γ-Glu-Cys-Gly）和γ-Glu-Val-Gly均具有CaSR激动剂活性，可以增强甜味、咸味和鲜味，而加入CaSR特异性拮抗剂NPS-2143则显著抑制厚味。这也是第一个研究表明CaSR在人类味觉感知中具有独特功能的报道。KURODA M等[45]的研究也证明了这一点，同时CaSR活性与厚味强度相关。但并不是所有的CaSR激动剂都是浓厚感物质，CaSR激动剂还包括γ-谷氨酰肽、部分阳离子、氨基酸药剂、多胺类和碱性肽类。所以γ-谷氨酰肽的生物检测法存在误差大的缺陷，适合于γ-谷氨酰肽的初步筛选，能够缩小人工筛选的范围，进而降低成本。

4.3 化学法

化学法主要包括超滤法、色谱法如凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和反相高效液相色谱（reversed-high performance liquid chromatography，RPHPLC）、质谱分析法如液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法、毛细管电泳-串联质谱（capillary electrophoresis tandem mass spectrometry，CE-MS/MS）法和电喷雾飞行时间质谱（electrospray timeof-flight mass spectrometry，ESI-TOF-MS）法以及核磁共振波谱（nuclearmgnetic resonance spectroscopy，NMR）法。为了能够更加准确地对γ-谷氨酰肽定性和定量检测，常将色谱法、质谱法和核磁共振波谱法联合使用。

4.3.1 超滤

超滤是一种以压力差为推动力的膜分离方法，通过膜组件的膜孔径将原料液分离和纯化，是一种快速、有效获得并浓缩目标分子质量的方法。FENG T等[46]通过超滤、凝胶渗透色谱和反相高效液相色谱对新鲜双孢菇中的部分肽进行了分离。从双孢菇中分离到的kokumi肽，将其添加至鸡汤中能够提高鸡汤的复杂性、厚味和适口性，经过超高效液相色谱耦合四倍飞行时间质谱法鉴定，其中的Gly-Leu-Pro-Asp和Gly-His-Gly-Asp是厚味产生的关键物质。

4.3.2 色谱法

（1）凝胶渗透色谱

凝胶渗透色谱是利用凝胶内部的网状结构，不同分子质量的被分离物在凝胶色谱柱内的通过路径不同，最终以不同的时间段被洗脱下来而达到将样品分离的目的。SHIBATA M等[47]运用超滤和凝胶渗透色谱（GPC）结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分离鉴定大豆种子水提液厚味的关键物质，发现γ-谷氨酰-酪氨酸和γ-谷氨酰-苯丙氨酸是被鉴定为“厚味”的关键物质。大豆种子中的棉子糖和水苏糖对增强γ-谷氨酰肽的“厚味”感觉有协同作用。这是首次报道γ-谷氨肽类和寡糖的联合使用可以增加“厚味”强度，这表明大豆提取物可以用来增强食品中的“厚味”口感。超滤、凝胶渗透色谱是根据分子质量大小来对原料液中的物质进行初步筛选，还需要通过液相色谱对所得组分进一步分离纯化得到单一纯化的γ-谷氨酰肽。

（2）高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）属于分配色谱，利用被分离组分在流动相和固定相中的分配特性差异从而实现分离。NAKAMOTO M等[48]采用高效液相色谱（HPLC）法、核磁共振和液相色谱仪-质谱（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）法对陈蒜提取物进行了研究，分离得到3种γ-谷氨酰三肽（γ-glutamyl-γ-glutamyl-S-allylcysteine，γ-glutamyl-γ-glutamyl-S-methylcysteine和γ-glutamyl-γ-glutamyl-S-1-propenyl-cysteine）；KURODA M等[49]采用高效液相色谱串联质谱法测定各类奶酪中γ-Glu-Val-Gly的含量。结果表明，奶牛和羊奶制作的奶酪中γ-Glu-Val-Gly浓度的不同是由于酪蛋白氨基酸序列的不同造成。

（3）反相高效液相色谱

食物中γ-谷氨酰肽的检测多通过反相高效液相色谱对样品进行分离。ZHU X P等[50]采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法分离全黄豆和脱脂黄豆发酵生产的两种酱油的美味肽，并通过超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱鉴定，从2种酱油中分别分离出16和14个美味肽，其中3个γ-谷氨酰二肽（γ-Glu-Glu、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Leu）。反相高效液相色谱具有灵敏、快速准确，重复性好，高效的特点，已被应用于多种食品的检测中，如酵母提取物、火腿、双孢菇、蚕豆中[47]。

4.3.3 质谱分析法

质谱分析法利用电场和磁场的作用将运动的带有不同质荷比的离子进行分离，通过测定离子的准确质量确定物质化学组成的方法[44]。随着质谱技术的发展，质谱分析也由简单的二级串联质谱发展到毛细管电泳-串联质谱技术和电喷雾飞行时间质谱等。

（1）液相色谱串联质谱

ZHAO J[51]在MRM模式下使用LC-MS/MS测定不同罗伊氏乳杆菌的γ-谷氨酰二肽（γ-glu、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-Val）在不同发酵时间（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）含量。结果表明，罗伊氏乳杆菌发酵的面团中γ-谷氨酰二肽的含量总体高于化学酸化的面团，延长发酵时间有利于γ-谷氨酰二肽的积累。在相同时间，不同菌株所产生的γ-谷氨酰二肽含量不同，说明菌株的特异性也决定了γ-谷氨酰肽的合成。

（2）毛细管电泳-串联质谱技术

HIRAYAMA A等[41]应用MRM模式，对比了液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）和毛细管电泳-串联质谱（CE-MS/MS）方法检测肝脏和血清样品中γ-谷氨酰二肽和三肽含量。结果表明，CE-MS/MS更能控制基质效应产生的影响。除此之外，CE-MS/MS还具有分离度好、灵敏度高、重现性好，回收率高等优势。

（3）电喷雾飞行时间质谱

SHAO S等[52]利用待测肽分子中含有金属元素的特点，将电喷雾飞行时间质谱（electrospray time-of-flight mass spec trometry，ESI-TOF-MS）和电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）相结合对天然富硒绿豆蛋白酶解样品中的硒进行鉴定和定量。通过检测肽分子中金属元素的含量间接得出待测肽分子的含量，最终γ-glutamyl-Se-methylselenocysteine的含量为1.2 mg/kg，使硒的总回收率达到72%。该方法具有检出限低、灵敏度高、线性范围宽等优点。

4.3.4 核磁共振波谱法

核磁共振波谱法是将核磁共振现象应用于分子结构中，通过图谱中提供的化学官能团的种类和数目进而确定化合物的化学组成。AMINO Y等[13]从分离的大蒜中鉴定了γ-L-glu-tamyl-S-（2-丙烯基）- l-半胱氨酸和γ-L-glu-yl-S-（2-丙烯基）-l-半胱氨酸亚砜的结构，通过与其合成的α-和γ-同分异构体的核磁共振波谱比较，对α-和γ-谷氨酰基二肽特征片段的鉴定，证明质谱分析是一种有效的检测谷氨酰二肽连接方式的方法。

随着科学的发展，γ-谷氨酰肽的分离、纯化技术更趋向于高效、省时和多样化的方向发展。根据不同的原料特性选择不同的分离鉴定方法，应就具体研究对象选取合适的方法，将各种方法联合使用取长补短，最终才能够达到理想的分离纯化效果。

5 结语

γ-谷氨酰肽广泛存在于植物、动物和发酵制品中。关于γ-谷氨酰肽的结构特征、呈味机制、制备工艺、分离和鉴定方法的研究已有了较多的报道。但仍然有许多科学问题需要进一步探究：①γ-谷氨酰肽的分子呈味机制。厚味产生机制并不是简单地通过厚味物质激活CaSR而产生的，可通过研究γ-谷氨酰肽的三维构象特征，从分子层面理解γ-谷氨酰肽的呈味机制和味感物质的相互作用，更深入的理解γ-谷氨酰肽的构效关系。②γ-谷氨酰肽在人体内的代谢机制。γ-谷氨酰肽作为正向变构调节剂，通过激活CaSR促进功能释放，CaSR受体在细胞外钙稳态中起中心作用，能够在甲状旁腺、肾脏和肠道在内的许多组织中表达，参与人体的各种生物学功能。③γ-谷氨酰用于肥胖病人健康膳食产品的开发。γ-谷氨酰肽能够增加食物的口感、延长回味，提升食物的丰富性和饱腹感，可以将其添加至低热量食品中，用于肥胖病人健康膳食产品的开发，为生产健康食品提供指导。

国外对于γ-谷氨酰肽的研究已有几十年，国内的研究起步较晚，但仍有多个优秀团队致力于γ-谷氨酰肽的研究，关于γ-谷氨酰肽还有多个科学问题需要进一步探究，所以加快γ-谷氨酰肽研发是未来值得深入研究的课题，对于推动调味品行业的健康发展具有重要意义。