MiR-216a-5p靶向TRIP4对乳腺癌细胞放射敏感性的影响及机制研究*

杨 霞，汤山松，谢仲梅，张 群

（四川省资阳市人民医院肿瘤科，资阳 641300）

乳腺癌是常见的妇科恶性肿瘤，放疗是其治疗手段之一，癌细胞对射线的敏感性是影响放疗效果的重要因素，但放疗抵抗性的出现使得乳腺癌治疗效果不佳，预后差，易复发[1-2]。miRNA 是一类内源性非编码RNA，负责转录后调控，不仅参与细胞多数生物学过程，也参与细胞耐药和治疗抵抗[3-4]。研究发现，miR-216a 与多种类型的恶性肿瘤的发生和发展有关，HOTTIP 通过上调miR-216a-5p 抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。miR-216a-5p 在膀胱癌细胞系中低表达，体外靶向抑制PAK2 基因抑制膀胱癌细胞系5637 和J82 的增殖能力，促进细胞凋亡[6]。miR-216a 通过抑制beclin-1 介导的自噬增强了胰腺癌细胞的放射敏感性[7]。然而，miR-216a-5p 对乳腺癌细胞放射敏感性的影响尚未可知。甲状腺激素受体相互作用蛋白4（TRIP4）是TRIP 家族成员之一，有报道发现TRIP4 在人黑素瘤细胞和组织中高表达，促进黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡；下调TRIP4增加细胞对药物的敏感性[8]。但TRIP4 在乳腺癌的作用尚不清楚。本文旨在研究miR-216a-5p 对乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制是否与TRIP4有关。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常乳腺上皮细胞MCF10A 和乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清、DMEM 培养基购自上海博湖生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒、实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司；MTT 试剂盒、Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自日本同仁化学研究所；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAT Bioquest 公司；二甲基亚砜（DMSO）、BCA 试剂盒、RIPA 蛋白裂解液、SDSPAGE试剂盒购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 正常乳腺上皮细胞MCF10A 和乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、SKBR-3 用含10% FBS 的DMEM 培养基培养，取对数生长期乳腺癌细胞MCF7，将si-con、si-TRIP4、miRcon、miR-216a-5p、anti-miR-con、anti-miR-216a-5p 质粒分别转染到MCF7 细胞，作为si-con 组、si-TRIP4组、miR-con组、miR-216a-5p组、anti-miR-con组、an‐ti-miR-216a-5p组，转染6 h后更换培养液，继续培养48 h，收集细胞备用；si-TRIP4 分别与anti-miR-con、anti-miR-216a-5p 质粒共转染至MCF7 细胞中，记为si-TRIP4+anti-miR-con 组、si-TRIP4+anti-miR-216a-5p 组，转染6 h 后更换培养液，继续培养48 h，收集细胞备用；以未经任何处理的MCF7 细胞作为空白对照（Control）组，细胞培养48 h后收集细胞备用。

1.2.2 qPCR分析miR-216a-5p和TRIP4表达水平 提取MCF10A、MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞以各组细胞的总RNA，合成cDNA 后进行qP‐CR。反应体系：2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上、下游引物各0.5 μL，7 μL 无菌水；循环条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环；融解曲线：95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。miR-216a-5p 和TRIP4分别以U6 和β-actin 为内参，相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-216a-5p 上游引物：5’-GGGTAATCT‐CAGCTGGCAA-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGT‐GGAGT-3’；TRIP4 上游引物：5’-CTGGGCTGTGT‐GGACCTAAT-3’，下游：5’-TCTCCTGGGTCAGA‐CAGCTT-3’；U6 上游引物：5’-GCTTCGGCAGCA‐CATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；β-actin上游引物：5’-ATCAC‐CATTGGCAATGAGCG-3’，下游：5’-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’。

1.2.3 Western blotting 检测蛋白表达MCF10A、MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 细胞以及各组细胞培养48 h 后，收集细胞，用RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白，BCA 法进行定量；然后进行SDS-PAGE，电压80V，时间2.5 h，然后在转膜液中通过电泳进行转膜，转至PVDF 上后用5%脱脂奶粉将PVDF 膜封闭1 h，加入一抗TRIP4、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3），稀释倍数为1∶1 000，置于4 ℃冰箱孵育过夜；加入二抗山羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000），室温孵育2 h，暗室曝光，显影，显影结束后，马上把X 光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。以β-actin 为内参，检测目的蛋白条带相对灰度值，即为蛋白表达相对表达水平。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖抑制率 各组细胞培养48 h，然后按照MMT 试剂盒说明进行操作，先加入MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min，最后用酶标仪检测490 nm 处吸光度（OD）值。细胞增殖抑制率(%)=1−实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h，收集细胞，PBS 漂洗，结合缓冲液重悬，加入10 μL 的Annexin V-FITC，轻轻混匀后加入5 μL 的PI，混匀，避光反应15 min；上流式细胞仪检测。

1.2.6 细胞克隆集落形成实验 取各组对数生长期细胞，按照照射剂量大小分别接种100个、200个、500个、1 000个、2 000个细胞，待细胞生长贴壁后分别给予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 射线的照射；继续培养2 周左右，用PBS 洗涤细胞2 次，然后用甲醇和吉姆萨进行固定、染色，低倍光学显微镜下计数＞50个细胞的集落。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 构建TRIP4 野生型（TRIP4-WT）和突变型（TRIP4-MT）荧光素酶表达载体，分别与miR-con 和miR-216a-5p 转染至MCF7细胞中，依据说明书要求，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

采用GraghPad Prism5 拟合细胞存活曲线，SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-216a-5p和TRIP4在乳腺癌细胞中的表达

与正常乳腺上皮细胞MCF10A 相比，乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 中TRIP4 mRNA及其蛋白表达水平升高，miR-216a-5p 表达水平降低（P＜0.05），见图1。

图1 miR-216a-5p和TRIP4在乳腺癌细胞中的表达情况

2.2 过表达miR-216a-5p促进乳腺癌细胞的放疗敏感性

与miR-con 组相比，miR-216a-5p 组MCF7 细胞中miR-216a-5p 表达水平升高，Cyclin D1 表达水平降低，Caspase-3 表达水平升高，细胞增殖抑制率显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图2A、图2C～图2F。用不同剂量射线照射后，大于4 Gy射线照射的miR-216a-5p 组细胞存活率低于miRcon 组，细胞克隆形成数显著降低（P＜0.05），图2B；miR-216a-5p组的放射增敏比（SER）是1.78，见表1。

图2 过表达miR-216a-5p促进乳腺癌细胞的放疗敏感性

表1 单击多靶模型参数值

2.3 沉默TRIP4 基因促进乳腺癌细胞的放疗敏感性

与si-con 组相比，si-TRIP4 组MCF7细胞中TRIP4 表达水平显著降低，Cyclin D1 表达水平显著降低，Caspase-3 表达水平显著升高，增殖抑制率显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图3A、图3B、图3D～图3G。不同剂量射线照射后，大于4 Gy 射线照射的si-TRIP4 组细胞存活率低于si-con组（P＜0.05），见图3C；si-con 组、si-TRIP4 组的D0值分别是3.22、1.33，si-TRIP4组的SER是2.43，见表2。

图3 沉默TRIP4基因促进乳腺癌细胞的放疗敏感性

表2 单击多靶模型参数值

2.4 miR-216a-5p对TRIP4表达的调控作用

TargetScan预测显示TRIP4 与miR-216a-5p 有互补的核苷酸序列（图4A）。miR-216a-5p与TRIP4-WT 共转染的细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）（图4B）。与miR-con 组相比，miR-216a-5p 组TRIP4 mRNA 和蛋白相对表达水平降低，与antimiR-con 组相比，anti-miR-216a-5p 组TRIP4mRNA和蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）（图4C、图4D）。

2.5 沉默TRIP4 可以逆转miR-216a-5p 对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响

与si-TRIP4+anti-miR-con 组相比，si-TRIP4+an‐ti-miR-216a-5p 组MCF7 细胞中TRIP4 表达水平显著升高（P＜0.05）（图5A、图5B）。单击多靶模型拟合计算得出，si-TRIP4+anti-miR-216a-5p 组的SER分别是0.48（表3）；细胞的存活拟合曲线显示，在同一剂量照射下，si-TRIP4+anti-miR-216a-5p 组细胞存活率高于si-TRIP4+ant-miR-con 组，存活曲线上移（图5C）。与si-TRIP4+anti-miR-con 组相比，si-TRIP4+anti-miR-216a-5p组Cyclin D1表达水平显著升高，Caspase-3 表达水平显著降低（P＜0.05）（图5F、图5G）；细胞增殖抑制率显著降低（P＜0.05）（图5D）；细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）（图5E）。

图4 miR-216a-5p靶向TRIP4

图5 沉默TRIP4可以部分恢复miR-216a-5p对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响

表3 单击多靶模型参数值

3 讨论

放射治疗是多种肿瘤治疗的重要手段，放疗抵抗的出现影响了其治疗效果，研究细胞的辐射敏感性机制对于深入了解肿瘤细胞的放疗耐受性以及开发肿瘤放疗增敏剂具有重要意义，而miRNA与肿瘤放疗敏感性密切相关[9]。研究报道，上调miR-216a-5p 可抑制乳腺癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力[10]。miR-216a-5p 高表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[11]。miR-216a通过抑制beclin-1介导的自噬增强胰腺癌细胞的放射敏感性[12]。为研究miR-216a-5p 在乳腺癌中作用及其对乳腺癌细胞增殖、凋亡及放射敏感性的问题，本实验首先检测正常乳腺上皮细胞MCF10A 和乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 中miR-216a-5p 的表达，结果显示miR-216a-5p 表达水平降低（P＜0.05），说明miR-216a-5p 可能与乳腺癌的进展有关。本实验进一步过表达miR-216a-5p 后，乳腺癌细胞MCF7 中Cyclin D1 表达水平降低，Caspase-3 表达水平升高，细胞增殖抑制率显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），说明过表达miR-216a-5p 可抑制乳腺癌细胞MCF7增殖，促进细胞凋亡。过表达miR-216a-5p后用不同剂量射线照射细胞，结果显示，克隆形成细胞数减少，存活分数降低（P＜0.05），表明过表达miR-216a-5p 可增强MCF7 细胞对射线的敏感性。本实验结果表明，miR-216a-5p 与在其他癌症中的作用相似，同样起抑癌作用。

TRIP4 是一个核转录共活化因子，有研究显示TRIP4 在多种肿瘤中均高表达，可能参与肿瘤的发生、发展[13]。TRIP4 在宫颈癌细胞和肿瘤组织中均高表达，TRIP4 通过激活MAPK、PI3K/AKT 信号传导促进肿瘤生长、迁移和侵袭，通过调节hTERT 以降低宫颈癌细胞的放射敏感性[14]。本实验结果显示，乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 中TRIP4 表达水平升高（P＜0.05）；沉默TRIP4 后，细胞增殖抑制率显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），说明沉默TRIP4 可抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡；沉默TRIP4 后用不同剂量射线照射细胞，结果显示克隆形成细胞数减少，存活分数降低（P＜0.05），表明沉默TRIP4 可增加MCF7 细胞放射敏感性。

Cyclin D1 是细胞周期相关蛋白，研究报道Cy‐clin D1 过表达参与乳腺癌细胞增殖[15]。Caspase-3是细胞凋亡关键因子，激活Caspase-3可促进细胞凋亡[16]。本实验结果显示，沉默TRIP4 和过表达miR-216a-5p 可降低Cyclin D1 表达水平，提高Caspase-3表达水平（P＜0.05）；说明沉默TRIP4 和过表达miR-216a-5p 可通过调控Cyclin D1、Caspase-3 蛋白抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，本研究还发现miR-216a-5p 可靶向调控TRIP4，抑制TRIP4 逆转了抑制miR-216a-5p 表达对乳腺癌细胞的放射增敏作用。

综上所述，过表达miR-216a-5p 可能通过下调TRIP4抑制乳腺癌细胞增殖、促细胞凋亡，从而增加细胞放射敏感性。