秦皮苷对脂多糖诱导的软骨细胞氧化应激和炎症因子的影响*

詹彦婷，覃再嫩，郑 立△

（广西医科大学 1.广西生物医药协同创新中心 广西－东盟重大疾病预防协同创新中心；2.广西组织器官修复医用生物材料工程技术研究中心，南宁 530021）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为一种致残率极高的疾病，给患者精神和经济都带来了沉重的负担[1]。OA 涉及整个关节的变化，包括透明软骨进行性丢失，软骨下骨发育不良、骨赘和骨包膜的厚度增加[2-3]。促进OA 发展的主要原因包括炎症介质过表达、降解酶的产生过多以及氧化应激等。其中，活性氧(ROS)引起的氧化应激能促进分解代谢，从而使软骨稳态遭到氧化及破坏，是软骨细胞损伤的主要原因[4]。目前，非甾体类抗炎药（NSAIDs）和阿片类的镇痛药已被应用于OA 的治疗，然而这些药物大部分情况下只能缓解OA 患者的症状，并且长期使用此类药物对人体会产生较大的副作用[5]。因此，在OA 的治疗策略上，可以采用抑制炎症、降低氧化应激和维持软骨代谢平衡的方法，有助于延缓OA的进展。

秦皮苷作为秦皮的有效成分，具有抑制炎症反应、减少氧化应激、降低肺血管通透性、护肝、护肾的作用[6]。研究发现，秦皮苷可以通过抑制核因子κB（NF-κB）和激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）信号通路，保护小鼠免于内毒素休克[7]。在脂多糖（LPS）诱导的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）小鼠模型中，秦皮苷能下调炎症基因白介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-1β 的表达，清除ROS，增加超氧化物歧化酶活性，从而避免氧化应激损伤[8]。在氧嗪诱导的高尿酸血症模型中，秦皮苷可以抑制肾脏中的相关转运体（如肾葡萄糖转运蛋白9 和尿酸转运蛋白1），从而使尿酸盐的排泄增加，达到抗高尿酸血症的目的[9]。然而，秦皮苷对LPS 诱导的OA 软骨细胞的作用和机制目前尚未见报道。本研究旨在探讨秦皮苷对炎症环境下软骨细胞的抗炎、抗氧化及软骨保护作用，以期为OA的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药物和主要试剂 秦皮苷(纯度≥95%)（麦克林，中国）；逆转录试剂盒（Fermentas Company，美国）；LPS、青/链霉素、MTT 试剂、总RNA 提取试剂盒、苏木精－伊红（HE）染色试剂盒、番红O 染色试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（Solarbio，中国）；二型胶原酶（Sigma，美国）；钙黄绿素/乙锭均二聚物（Calcein-AM/EthD-I）染色试剂(百奥莱博，中国)；ROS检测试剂盒（碧云天，中国）；基质金属蛋白酶(MMP)-13 一抗、FITC 免疫荧光抗体（博士德，美国）；胎牛血清、DMEM 培养基（Gibco，美国）；引物（金开瑞，中国）。

1.2 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠，3～5 日龄，体重10～12 g，购自广西医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK 桂2020-0004。本研究涉及的动物实验由广西医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：202010001。

1.3 T-AOC 检测 使用T-AOC 检测试剂盒评估秦皮苷的总抗氧化水平。在酸性状态下，秦皮苷能将Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）还原，生成蓝色的Fe2+-TPTZ。秦皮苷按照对倍稀释的方法配置成不同浓度（0 µg/mL、0.3125 µg/mL、0.625 µg/mL、1.25µg/mL、2.5 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、160 µg/mL）的溶液，取秦皮苷溶液30 µL，工作液900 µL 和双蒸馏水90 µL，充分混合，室温条件下孵育10 min，加入100 µL 的混合液于96 孔板，并用酶标仪检测593 nm 处的吸光度（OD）值。

1.4 软骨细胞的提取、培养及鉴定 麻醉处死大鼠，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤，无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），置于含1%的青/链霉素的PBS 中，去除软骨周围组织，将软骨剪为1 mm×1 mm×1 mm 的小块，胰蛋白酶消化30 min，含2 mg/mL的Ⅱ型胶原酶37 ℃下消化4 h，1 000 r/min 离心5 min，收集并重悬细胞于DMEM 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每两天换1次液，待细胞密度约为90%时，对细胞进行传代，使用第3 代细胞进行后续实验。通过HE染色和番红O染色法进行软骨细胞鉴定。

1.5 MTT法检测软骨细胞增殖率 通过MTT法检测软骨细胞增殖率，以评价秦皮苷对软骨细胞的毒性作用，具体步骤：将软骨细胞接种于96孔板，待细胞充分贴壁后，加入100 µL 浓度分别为0 µg/mL、0.312 5 µg/mL、0.625 µg/mL、1.25 µg/mL、2.5 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL、80µg/mL 的秦皮苷溶液，培养24 h，弃去培养基，PBS清洗，换新培养基，加入MTT 试剂10 µL，置于37oC 培养箱中，4 h 后将培养基弃去，加入DMSO 100µL，37oC 避光孵育15 min，用酶标仪检测490nm 处各孔的OD 值。细胞增殖率=[(实验组OD－空白调零孔OD)/(对照组OD－空白调零孔OD)]×100%。实验重复3次。

1.6 细胞分组和干预 将细胞分为对照组、模型组和处理组。对照组只加入完全培养基，模型组加入含10 µg/mL LPS 的完全培养基，处理组先提前1 h加入含10µg/mL LPS 的培养基诱导软骨细胞损伤，随后加入5µg/mL 秦皮苷的完全培养基。将细胞种植于6孔板中，待24 h细胞贴壁后，经过相应的药物处理24 h 后，收集细胞。通过HE 染色和番红O 染色法评价秦皮苷对LPS诱导OA软骨细胞的作用。

1.7 Calcein-AM/EthD-I 染色检测细胞活性 将细胞爬片置于6 孔板中，调整细胞密度为2×105个/孔，待细胞密度达到80%～90%时，药物处理24 h，PBS清洗3次，加入0.05%Calcein-AM 和0.2%EthD-I染色试剂在暗室中37oC 孵育5 min，PBS 清洗掉荧光试剂，在荧光显微镜下观察细胞的生存情况并拍照，用Image J 软件统计活细胞和死细胞数目，计算细胞增殖率。

1.8 二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针检测软骨细胞内ROS 按照1∶1 000 的比例用无血清培养基稀释DCFH-DA荧光探针，使终浓度为10µmol/L。弃去细胞培养基，加入0.5 mL DCFH-DA 荧光探针稀释液，在37oC的CO2培养箱中避光孵育20 min，每3～5 min混匀1次，用无血清培养基将爬片洗涤3遍，在荧光显微镜下观察细胞的荧光强度，用Image J 软件分析荧光强度的平均值，荧光强度越强，细胞内的ROS水平越高。

1.9 免疫荧光染色检测软骨细胞MMP-13 的分泌情况 用PBS 洗涤细胞爬片3 次后，将细胞爬片置于3% H2O2中孵育15 min，PBS 洗涤3 次，与山羊血清温育15 min，弃去血清；滴加一抗（MMP-13，1∶100）37oC孵育4 h，PBS洗涤3次；二抗（FITC-抗兔IgG，1∶100）37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，吸去水分，荧光显微镜下观察荧光图像并拍照，用Image J软件分析荧光强度的平均值，绿色荧光强度越强，MMP-13的水平越高。

1.10 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测相关基因的表达 提取细胞RNA，逆转录为cDNA，使用LightCycler®96 实时荧光定量PCR 仪（Roche，瑞士）进行qPCR反应，用GADPH作为内参，检测炎症基因IL-6、MMP-3、MMP-13 和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）以及软骨特异性基因Col2al 的表达情况。引物序列见表1。实验重复3次，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

表1 PCR引物序列

1.11 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SKN-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 秦皮苷的T-AOC 在秦皮苷浓度为1.25 µg/mL时，总抗氧化水平较高（P＜0.05），并且随着秦皮苷浓度的增加，总抗氧化水平也相应升高（图1），表明秦皮苷具有良好的抗氧化的能力。

图1 秦皮苷的T-AOC

2.2 软骨细胞的鉴定结果 HE 染色显示：细胞形态呈多边形或椭圆形（图2A），符合软骨细胞形态特征。番红O 染色中，碱性染料与细胞蛋白多糖结合，使细胞变为红色（图2B），细胞具有分泌蛋白多糖的功能，表明提取的细胞为软骨细胞。

图2 SD大鼠软骨细胞的鉴定

2.3 秦皮苷对软骨细胞的毒性作用 秦皮苷浓度低于5µg/mL 时，对软骨细胞无明显毒性（P＞0.05）（图3）。因此，选择5 µg/mL 作为秦皮苷的工作浓度。

2.4 秦皮苷对LPS 诱导OA 软骨细胞的作用 HE染色结果显示：对照组软骨细胞形态正常，模型组软骨细胞数量较对照组明显减少，细胞呈长梭型，与成纤维细胞形态类似；与模型组相比，秦皮苷处理后软骨细胞形态改善，细胞数量显著增加，形态接近于正常软骨细胞（图4），表明秦皮苷可以维持软骨细胞的正常形态。

番红O 染色显示：对照组有大量蛋白多糖分泌，经LPS 处理后，模型组颜色变浅，蛋白多糖的分泌量（红色细胞数）显著减少，且经秦皮苷处理后，蛋白多糖分泌量（红色细胞数）明显高于模型组（图5），说明秦皮苷可以促进蛋白多糖的分泌。

图3 MTT检测秦皮苷对软骨细胞的毒性作用

2.6 3 组软骨细胞活力比较 与对照组比较，模型组存活细胞数量显著减少，细胞增殖率下降（P＜0.001）；经秦皮苷处理后，与模型组相比，处理组存活细胞数量增加，细胞增殖率升高（P＜0.001）（图6），表明秦皮苷能促进软骨细胞的增殖。

2.7 3 组细胞内ROS 水平比较 与对照组比较，模型组荧光强度明显提高（P＜0.001），说明细胞内的ROS 水平显著升高；与模型组相比，处理组荧光强度明显降低（P＜0.001），说明细胞内的ROS 水平明显降低，见图7。

2.8 3组软骨细胞MMP-13表达比较 与对照组相比，模型组MMP-13 的表达升高（P＜0.001）；与模型组相比，处理组MMP-13 表达明显降低（P＜0.001），见图8。

2.9 3组软骨细胞特异性基因及炎症相关基因表达比较 模型组IL-6、MMP-3、MMP-13 和iNOS 基因的表达均高于对照组(P＜0.001)，软骨特异性基因Col2al 的表达降低（P＜0.001）。与模型组相比，处理组炎症基因IL-6、iNOS、MMP-3 和MMP-13 的表达明显降低（P＜0.05），软骨特异性基因Col2al的表达升高（P＜0.05）(图9)。提示秦皮苷可以逆转炎症相关基因及软骨特异基因的表达。

图4 细胞HE染色图（×100）

图5 细胞番红O染色图（×100）

图6 Calcein-AM/EthD-I染色检测细胞的活性

图7 荧光探针检测细胞内的ROS

图8 免疫荧光染色显示MMP-13的表达情况

图9 特异性软骨基因和炎症相关基因的表达

3 讨论

OA 作为一种慢性退行性病变，多涉及关节软骨，软骨下骨和滑膜等部位[10]。软骨变性的最关键特征是基质降解酶（包括MMP 和蛋白聚糖）的上调。研究表明，由炎症介质过度表达引起的氧化应激可导致分解代谢酶增加，细胞外基质降解，OA 症和软骨细胞凋亡，从而促进了OA 的整体进展[11]。秦皮是临床常用的中药，具有清热解毒、消炎、抗氧化、抗菌、抗高尿酸血症和平喘止咳等功能[12-14]。秦皮苷是秦皮的有效活性成分，在LPS 诱导的ARDS小鼠模型中，具有明显的抗炎及抗氧化的作用。但目前尚未有研究报道秦皮苷对OA 的作用，本研究探讨了秦皮苷对LPS 诱导的体外OA 模型的影响。结果发现，在一定浓度范围内，秦皮苷具有抑制软骨细胞外基质降解、减少炎症介质和抗氧化作用，在一定程度上延缓了OA的进展。

关节软骨周围有大量的细胞外基质，而基质仅由软骨细胞产生，一旦受损，关节软骨内源性修复困难[15]。细胞外基质的主要成分是胶原和蛋白多糖，细胞外基质合成与降解的不平衡是导致OA 的主要因素[16]。因此，维持细胞外基质分解代谢的平衡，对于OA 的治疗具有至关重要的作用。MTT 结果显示，5 μg/mL 的秦皮苷对软骨细胞无毒性，Cal‐cein-AM/EthD-I染色结果表明，秦皮苷在该浓度下，能促进软骨细胞的增殖，抑制细胞的凋亡。蛋白多糖作为软骨细胞外基质的重要组成部分，其分泌的减少不利于软骨的生长，而蛋白多糖的分泌的增加则有助于调节细胞外基质稳态[17]。HE 和番红O 染色结果显示，秦皮苷能维持软骨细胞的正常形态，增加蛋白多糖的分泌，对软骨起保护作用。MMPs参与胶原降解，MMP-13是软骨分解代谢的关键酶，其过表达会导致细胞外基质降解[18-19]。MMP-13 在软骨细胞的分解代谢活动中起着重要的作用，抑制MMP-13 的表达有助于保护软骨[20]。本研究结果显示，秦皮苷能抑制MMP-3和MMP-13的表达(均P＜0.05)，有利于维持软骨分解代谢的平衡，避免细胞外基质的降解。此外，秦皮苷可上调软骨特异性基因Col2al的表达(P＜0.001)，提示秦皮苷能促进Ⅱ型胶原的合成，间接促进软骨细胞外基质的形成。

过量ROS 引起的氧化应激是引起软骨降解和OA 的主要原因，清除ROS 可以抑制氧化应激，对OA 的治疗起着重要的作用[21]。T-AOC 结果表明，秦皮苷具有良好的抗氧化性能，并且随着秦皮苷浓度的增加，其抗氧化能力也增加。DCFH-DA 荧光探针的结果也表明了秦皮苷具有清除软骨细胞内ROS、抑制氧化应激的作用。研究表明，炎症对OA的发展起着重要的作用，炎症因子的过度表达往往导致骨与软骨的破坏[22]。因此，抑制炎症因子的过表达有助于延缓OA 的进展。据文献报道，秦皮苷能通过降低炎性介质IL-1β 和IL-6 的表达，抑制JAK/STAT 和激活NF-κB 信号通路，以达到缓解肺炎克雷伯菌所致重症肺炎症状的目的[23]。本研究qPCR 结果显示，秦皮苷能抑制LPS 诱导IL-6、iNOS的过度表达（均P＜0.05），表明秦皮苷能抑制LPS诱导的炎症，以发挥对软骨的保护作用。

综上所述，秦皮苷可以抑制炎症因子和分解代谢基因的过表达，促进软骨特异性基因的上调，清除ROS，对软骨细胞具有良好的抗炎、抗氧化和保护作用。因此，秦皮苷在LPS 诱导的体外OA 模型中具有抗氧化、抗炎的作用，其有望应用于OA 的治疗，作用机制有待进一步研究。