乳铁蛋白对正畸复发移动过程中牙周改建的影响*

张宏宏，卢海丽，陈 媛，康 娜

（广西医科大学附属口腔医院，南宁 530021）

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）于1960 年由Groves[1]首次从牛乳中分离获得，由689个氨基酸残基组成，分子量为70～80 ku[2]。它广泛存在于外分泌液或血浆、中性粒细胞中，属于转铁蛋白家族[3-5]。有研究表明，LF 是一种具有抗炎、抗微生物和免疫功能的多效因子[6-7]。此外，LF在骨代谢方面的作用也逐渐受到关注。LF 不仅能够增强成骨前体细胞的成骨分化，促进成骨细胞的增殖并抑制其凋亡，还可以抑制破骨细胞生成，降低破骨细胞活性[8-10]。鉴于LF 在促进成骨、抑制破骨方面的效果明显，结合骨改建是正畸牙移动的生物学基础，推测LF可能影响正畸牙移动的复发程度。目前LF 对正畸复发移动影响的研究较少。本研究将LF灌注到大鼠体内，探讨正畸保持期间LF对牙周组织改建的影响，旨在为正畸保持期间如何快速稳定疗效提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 36 只雄性SD 大鼠，8 周龄，体重（240±10）g，购于广西医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK 桂2014-0002），于标准鼠笼中饲养，饲养环境湿度56%，温度18～20 ℃，12 h 间隔照明。本实验经广西医科大学动物伦理委员会批准。

1.2 大鼠正畸牙模型的建立 动物适应性喂养1周后，按45 mg/kg体重腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，充分麻醉后将大鼠固定于手术台上，在第一磨牙近中侧与切牙远中侧之间安装镍钛拉簧（直径0.304 8 mm），力值控制为40 g，加力21 d 后麻醉下拆除镍钛拉簧，并测量大鼠第一磨牙近中移动距离，见图1。

图1 大鼠正畸牙移动模型（图片转载自Ma等[11]）

1.3 动物分组和大鼠复发移位距离测量 拆除加力装置后，将大鼠随机分为实验组和对照组，每组18 只。实验组给予LF（85 mg/kg）灌胃，1 次/d，连续21 d，对照组给予等量生理盐水。

分别于灌胃7 d、14 d、21 d，两组各取6 只大鼠，麻醉处死。在加力装置去除时和处死时制取上颌印模，灌注石膏模型，用游标卡尺测量并计算灌胃前、后复发移位距离（即第二磨牙远中沟与第一磨牙近中沟的距离），共测量3次，取平均值。

1.4 标本制作 大鼠处死后取上颌第一磨牙及其牙周组织，4%多聚甲醛固定24 h，冲洗，10%EDTA-2Na 溶液脱钙6～8 周，常规脱水、包埋、切片，切片方向为近远中向纵切，厚度为（4±1）μm。

1.5 苏木精－伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色 选取每个时间点第一磨牙牙周组织的切片，常规二甲苯脱蜡10 min，梯度乙醇水化，苏木精染色10 min，返蓝1 min，1%伊红染色10 min，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。将切片置于光学显微镜下观察，随机选取两组牙根近中侧、远中侧的5 个视野，观察不同时间点牙周组织的变化。

1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色 选取每个时间点的第一磨牙牙周组织的切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，行TRAP染色，37 ℃避光孵育1 h，苏木精复染2 min，中性树脂封片。将切片置于光学显微镜下观察，随机选取两组牙根近中侧、远中侧的5个视野进行破骨细胞计数。

1.7 免疫组织化学染色 选取每个时间点的第一磨牙牙周组织的切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，高温高压抗原修复10 min，3%H2O2孵育30 min，山羊血清室温封闭15 min，滴加一抗骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP，1∶500，购自美国CST公司），4 ℃冰箱孵育过夜，滴加二抗（1∶1 000，购自美国CST 公司）室温孵育15 min，DAB 显色1 min，苏木精复染1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。随机选取两组牙根近中侧、远中侧的5个视野，光学显微镜下观察。采用Image-pro-plus 6.0 软件分析测量平均光密度值。平均光密度值越大，蛋白阳性表达越高，阳性表达的细胞呈棕黄色。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件分析数据。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠第一磨牙近中移动距离 镍钛拉簧持续加力21 d 后，实验牙均出现明显近中移动。实验组大鼠实验牙近中移动距离为（1.13±0.17）mm，与对照组的（1.09±0.21）mm 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明大鼠正畸牙移动模型建立成功。

2.2 大鼠上颌第一磨牙的复发距离 拆除镍钛拉簧后大鼠实验牙均向远中复发移动，时间越长复发距离越大，与对照组比较，实验组各时间点的复发距离均小于对照组（均P＜0.05），见表1。

表1 两组大鼠第一磨牙复发距离比较 mm，±s，n=6

表1 两组大鼠第一磨牙复发距离比较 mm，±s，n=6

2.3 HE 染色结果 近中侧：7～21 d，两组牙周膜间隙逐渐增宽，21 d时恢复正常，牙周膜纤维逐渐变规则，7 d 时均可见明显的骨吸收陷窝，随着时间延长逐渐消失，与对照组比较，随着时间延长实验组牙槽骨表面更为平整，牙槽骨内出现较多新骨沉积；远中侧：7～21 d，两组牙周膜间隙逐渐变狭窄，牙周膜纤维都逐渐变规则，14 d 时对照组可见少量骨吸收陷窝，与对照组比较，随着时间延长实验组牙槽骨表面更为平整且出现新骨形成线，对照组仅有少量新骨沉积，见图1。

2.4 TRAP计数 随着时间延长，两组牙根近中侧、远中侧破骨细胞数逐渐减少，21 d时，对照组牙根近中侧破骨细胞数量稍有增多，但与7 d、14 d比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，实验组14 d 时牙根远中侧破骨细胞数量显著减少，21 d 时牙根近中侧、远中侧破骨细胞数量均显著减少（均P＜0.05），见图2、图3。2.5 免疫组化染色 随着时间延长，两组牙根近中侧、远中侧BSP 表达逐渐升高；与对照组比较，实验组7 d 时牙根近中侧BSP 表达异显著升高（P＜0.05），21 d 时牙根近中侧、远中侧BSP 表达异显著升高（P＜0.05），见图4、图5。

图1 大鼠第一磨牙牙周组织HE染色图（×200）

图2 大鼠第一磨牙牙周组织的TRAP染色图（×200）

图3 大鼠第一磨牙牙根近中侧、远中侧破骨细胞数量比较

图4 大鼠第一磨牙牙周组织的IHC染色图（×200）

3 讨论

图5 大鼠第一磨牙牙根近中侧、远中侧BSP表达比较

促进牙槽骨成骨或抑制其发生破骨活动可以有效减少正畸牙复发移动[12-13]，LF是一种多效因子，其在骨代谢方面的效能尤为突出，LF一方面可以提高成骨细胞数量、加强成骨细胞矿化基质的能力从而促进成骨。另一方面，通过抑制形成于前驱细胞的破骨细胞分化而抑制成骨[14-17]。Blais 等[18]与Naot等[19]认为生理浓度的LF 能以剂量依赖性方式显著刺激成骨样细胞和破骨细胞系的增殖；Liu 等[8]从分子水平阐明LF 诱导的MC3T3-E1 成骨细胞增殖是由c-Fos 和c-Jun 通过JNK、ERK 和p38 信号通路所介导。本研究对大鼠拆除加力装置后，用LF进行灌胃，观察其对正畸牙复发移动的影响，结果显示，与对照组比较，实验组的复发距离均较小，且各个时间点的差异显著（P＜0.05），表明LF 有助于抑制正畸牙移动后的复发；此外，本研究通过HE 染色发现，与对照组比较，实验组大鼠近、远中侧的新骨形成速度均较快，可能是实验组LF干预促进了成骨细胞的增殖，加快了成骨速度，使牙齿更快稳定在新的位置，该结果与学者们的研究结果相类似。本实验还发现，在7～14 d 中，与对照组比较，实验组出现明显的类骨小梁结构的新生骨质沉积，笔者推测：7～14 d的时间段是LF发挥作用的最佳时期。

BSP是骨和其他矿化组织中主要的非胶原蛋白组分，引导和调节骨组织矿化[20]。在本实验中，与对照组比较，实验组实验牙近、远中侧BSP 的平均光密度值均较高，在近中侧，7 d、21 d 时差异显著（P＜0.05），在远中侧，21 d 时差异显著（P＜0.05）。有学者使用LF 对成骨细胞进行诱导矿化，结果显示，LF可以有效促进成骨细胞矿化成熟[21]。综合前人的研究与本实验BSP 表达结果，我们推测在大鼠正畸牙复发移动阶段，LF可促进正畸牙牙周膜内BSP的表达，从而促进了骨组织的矿化成熟。同样地，在颅骨再生研究中，有学者也发现BSP 可促进成骨细胞分化，含BSP 涂层的骨缺损支架其骨形成趋势明显增加[22-23]。

牙周骨改建受到成骨细胞与破骨细胞相互影响。本实验TRAP染色显示，与对照组比较，实验组实验牙近、远中侧破骨细胞数量均较低，在近中侧，21 d 时差异明显（P＜0.05），在远中侧，14 d、21 d 时有明显差异（P＜0.05）。本课题组推测LF 在一定程度可以抑制破骨细胞的形成来抑制成骨，而且从时间点来推测，LF抑制破骨细胞的形成可能是一个缓慢的过程，这与Inubushi等[24]学者的研究相符。

基于上述研究结果与其他学者的结论，本文推测LF 的干预可以有效减少大鼠正畸牙复发移动距离，促进正畸牙牙周组织的改建。本研究丰富了LF在正畸牙复发移动阶段牙周骨改建领域的认识，但是，LF 对牙周骨改建的具体机制尚未了解，还需要进一步去探索和实验。