高湿贮藏对青椒果实冷害和抗氧化活性的影响

张 萌，曹婷婷，程紫薇，金文渊，金 鹏，郑永华,*

（1.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095；2.苏州大福外贸食品有限公司，江苏 苏州 215000）

青椒（Capsicum annuumL.）又称甜椒、菜椒，为茄科辣椒属草本植物，其营养物质十分丰富，具有开胃消食、降压减脂和抗氧化等功效[1-2]。由于青椒的含水量高，采后在常温下生理代谢旺盛，具较高的呼吸强度和蒸腾速率，极易失水萎蔫，导致其商品性大大降低。低温贮藏可降低青椒果实的采后生理代谢，有效延长贮藏期，但青椒是一种冷敏性蔬菜，当贮藏温度低于7～9 ℃时即发生冷害，出现果面点蚀凹陷、花萼褐变、果实发软等冷害症状[3-5]，严重影响其外观和食用品质。目前已有间歇升温[3]、热水处理[5]、甘氨酸甜菜碱处理[6]等物理和化学方法来减轻青椒果实冷害的研究，显示研发安全和高效的采后处理方法对减轻青椒果实冷害及其冷链贮运具有重要的实践意义。

贮藏环境的相对湿度（relative humidity，RH）是影响新鲜果蔬蒸腾作用的主要因素，与果蔬贮藏期长短密切相关。低RH条件下贮藏的果蔬极易发生失水萎蔫，从而造成品质劣变，缩短贮藏期。而高湿的贮藏环境可显著抑制蒸腾失水造成的产品失鲜，如王剑功等[7]发现90%～96% RH贮藏条件能显著延缓菠菜和韭菜的蒸腾失水和萎蔫，保持其新鲜度。Ktenioudaki等[8]研究发现，高湿贮藏可降低草莓果实的质量损失率，维持较高的VC和花青素等营养物质含量，因而具有良好的保鲜效果。但有关RH条件对果蔬冷害影响的研究较少。前人研究表明采用塑料薄膜包装等保湿的高湿贮藏方式可显著降低番茄[9]和脐橙[10]的冷害发生率，延长贮藏期。因此新鲜果蔬贮藏要求较高的环境湿度，一般RH要控制在85%～95%[11]。但目前普通冷库的RH仅为70%～75%，不能满足果蔬贮藏的需求。采用塑料薄膜包装保湿因简单易行而得到普遍应用，但不符合绿色环保的发展理念；采用超声波和高压喷雾技术对库体加湿因水雾颗粒较大，低温下易发生结露现象，导致病原菌的滋生和果蔬腐烂率的升高[12-13]。而干雾湿度控制系统产生的水雾颗粒直径仅为2～10 μm，能均匀地扩散到空气中，可提供90%～99%精确均匀的高RH而不会在果蔬表面结露。采用该加湿技术的高湿冷库贮藏可显著抑制奶白菜、番石榴、青花菜等果蔬的失水和品质劣变，并可有效减轻黄瓜果实的冷害症状，延长贮藏期[14-16]，显示干雾控湿高湿贮藏方式在果蔬冷链贮运保鲜中有良好的发展前景。但有关干雾控湿高湿贮藏对青椒等其他冷敏性果蔬冷害的影响鲜见报道。本实验研究了干雾控湿高湿冷库和普通低湿冷库贮藏对典型冷敏性蔬菜青椒冷害、品质以及活性氧代谢的影响，以期从果实抗氧化系统角度探究高湿贮藏减轻青椒果实冷害的作用和机理，为高湿贮藏应用于青椒的冷链贮运提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为‘圆椒875’，购于苏州市吴中区金庭镇东河农贸市场。选择大小适中、果面光滑、无机械伤和病虫害的青椒备用。

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、钼酸铵、草酸、水杨酸、愈创木酚、盐酸羟胺、四氯化钛、α-萘胺、碳酸钙粉 上海麦恪林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、乙酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvinylpyrrolidone，PVPP）、曲拉通（Triton X-100） 北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸、甲硫氨酸（methionine，Met）、氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）、核黄素、聚乙二醇6000（PEG） 上海瑞永生物科技有限公司；偏磷酸、硫酸亚铁（FeSO4） 上海源叶生物科技有限公司；丙酮、浓氨水、乙醇、乙酸、过氧化氢、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠 国药集团化学试剂有限公司；硫酸、盐酸 南京化学试剂股份有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

湿度控制系统 以色列Hygrotech公司；RS-YS-W-A型GSP无线温湿度测点、RSWS-ETH-6型以太网温湿度记录仪 山东仁科测控技术有限公司；UV-1200型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；GL-20G-H冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；DDS-11A电导率仪 上海第二分析仪器厂；DK-S26型电热恒温水浴锅上海森信实验仪器有限公司；FA1104电子天平 上海精密科学仪器有限公司；TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司；PAL-1QL-861型振荡仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将青椒果实随机分为两组，放入铺有泡沫网垫的塑料周转筐（810 mm×570 mm×500 mm）中，每组18 筐，每筐20 个果实，将其放入4 ℃的干雾控湿高湿冷库（R H 9 6%～9 9%）和普通低湿冷库（RH 70%～75%）。每3 d从两个冷库中随机取出青椒各60 个，用于冷害指数、相对电导率和硬度的测定，同时取果实可食部位样品于液氮中速冻后在-80 ℃下贮藏用于其他指标的测定。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 冷害指数和相对电导率的测定

冷害指数的测定参照侯建设等[17]的方法，按照冷害斑面积的大小将青椒果实的冷害程度分为4 级：0级，无冷害症状；1级，轻微冷害，冷害斑面积不超过果面积的10%；2级，中度冷害，冷害斑面积占果面积的10%～40%；3级，严重冷害，冷害斑面积超过果面积40%。冷害指数按照公式（1）计算。

式中：i为冷害级别；ni为发生i级冷害的果实个数；N为果实总数。

相对电导率的测定参照姚文思等[18]的方法，并略作修改。用直径为1 cm的打孔器从青椒果实的中间部位取下5 个小圆片，将其置于20 mL的蒸馏水中，充分振荡后立即测量浸出液的电导率（κ0/（S/cm）），然后在室温下静置30 min，再次测量其电导率（κ1/（S/cm）），最后将浸出液煮沸20 min并充分冷却，测量其电导率（κ2/（S/c m））。相对电导率按照公式（2）计算。

1.3.2.2 质量损失率和果实硬度的测定

质量损失率采用称质量法进行测定。称贮藏前青椒的质量为（m1/g），贮藏固定时间后将青椒从冷库中取出立即放到电子天平上称质量（m2/g），防止空气中的水蒸气凝结而影响青椒质量。质量损失率按照公式（3）计算。

果实硬度采用质构仪进行测定，选用直径为2 mm的P/5型不锈钢探头，起始力为0.4 N，穿刺距离为3 mm，测定速率为1.0 mm/s，单位为N。

1.3.2.3 叶绿素、抗坏血酸、总酚和总黄酮含量的测定

叶绿素含量的测定参照Xing Yage等[19]的方法，并略作修改。取1 g青椒样品，加入6～7 mL 80%（体积分数，下同）预冷丙酮、少量石英砂和碳酸钙粉充分研磨，12 000 r/min离心20 min，将上清液转入10 mL容量瓶后继续加入2～3 mL 80%预冷丙酮进行二次提取，重复上述步骤，定容。分别测定上清液在646 nm和663 nm波长处的吸光度。

抗坏血酸含量采用钼蓝比色法进行测定。

总酚和总黄酮含量的测定参照Wang Li等[20]的方法。

以上指标结果均以干质量计，单位为mg/g。

1.3.2.4 抗氧化酶活力的测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的测定参照Xing Yage等[19]的方法。取1 g青椒样品，用5 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）进行充分研磨，12 000 r/min离心20 min后得到粗酶液。反应体系包括2.6 mL反应液（含0.1 mol/L磷酸钠缓冲液1.7 mL、13 mmol/L Met 0.3 mL、750 μmol/L NBT 0.3 mL、100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL）、0.1 mL粗酶液和0.3 mL 20 μmol/L核黄素溶液。以每分钟反应体系在560 nm波长处对NBT光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定参照Cakmak等[21]的方法。取1 g青椒样品，用5 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）进行充分研磨，12 000 r/min离心20 min后得到粗酶液。反应体系包括3.5 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液、0.2 mL 0.75% H2O2和0.3 mL粗酶液。以每分钟反应体系在240 nm波长处吸光度减少0.01为一个酶活力单位（U）。

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参照Kochba等[22]的方法，并略作修改。取1 g青椒样品，用5 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5，含1 mmol/L PEG、4 g/100 mL PVPP和1% Triton X-100）进行充分研磨，12 000 r/min离心20 min后得到粗酶液。反应体系包括3.0 mL 25 mmol/L愈创木酚、0.15 mL粗酶液和0.2 mL 0.5 mol/L H2O2。以每分钟反应体系在470 nm波长处吸光度增加1为一个酶活力单位（U）。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的测定参照Nakano等[23]的方法。APX粗酶液提取方法同CAT，反应体系包括4.6 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液、0.1 mL 9 mmol/L抗坏血酸、0.2 mL粗酶液和0.1 mL 3% H2O2。以每分钟反应体系在290 nm波长处吸光度减少0.01为一个酶活力单位（U）。

以上酶活力结果以蛋白质量计，单位均为U/mg。

1.3.2.6 DPPH自由基清除率和羟自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定参照Brand-Williams等[25]的方法，并略作修改。取1 g青椒样品，用5 mL 90%甲醇溶液进行充分研磨，12 000 r/min离心20 min后得到上清液。反应体系包括0.1 mL上清液和1.9 mL 120 μmol/L DPPH甲醇溶液，以90%甲醇溶液代替上清液作为对照，在25 ℃下避光反应30 min，测定515 nm波长处的吸光度。

羟自由基清除率的测定参照张兰杰等[26]的方法，并略作修改。取1 g青椒样品，用5 mL 50%乙醇溶液进行充分研磨，12 000 r/min离心20 min后得到上清液。反应体系包括0.5 mL上清液、1.5 mL 18 mmol/L水杨酸、2.0 mL 18 mmol/L FeSO4和0.3% H2O2，以50%乙醇溶液代替上清液作为对照，在37 ℃下避光反应30 min，测定510 nm波长处的吸光度。

1.3.2.7 可溶性蛋白质含量的测定

可溶性蛋白质含量的测定参照Bradford[27]的方法，以牛血清白蛋白为标准。

1.4 数据统计与分析

以上指标均重复测定3 次。采用WPS Office 2019和SAS 9.2软件对数据进行统计与分析，采用Origin 8.0软件作图。数据的差异显著性分析采用邓肯氏多重比较法，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高湿贮藏对青椒果实冷害指数和相对电导率的影响

图1 高湿贮藏对青椒果实冷藏期间冷害指数（A）和相对电导率（B）的影响Fig.1 Effect of high relative humidity storage on chilling injury index (A) and relative electric conductivity (B) of green pepper fruits during cold storage

如图1A所示，在贮藏期间，青椒果实的冷害指数随贮藏时间的延长而不断升高，且高湿组的冷害指数显著低于低湿组（P＜0.05）。在青椒果实贮藏结束时，高湿组的冷害指数为37.04%，比低湿组低54.54%，这表明高湿贮藏可减轻青椒果实的冷害症状，延长果实贮藏寿命。相对电导率可反映果实贮藏期间细胞膜的通透性及完整性，是衡量冷害的重要指标之一。如图1B所示，青椒果实的相对电导率在贮藏过程中呈不断上升趋势，但高湿组的相对电导率在6 d后显著低于低湿组（P＜0.05），表明高湿贮藏可减轻细胞膜的损伤，维持其完整性和功能性，从而有效抑制冷害的发生。

2.2 高湿贮藏对青椒果实质量损失率和硬度的影响

如图2A所示，低湿组青椒果实在贮藏期间，其质量损失率随贮藏期的延长急剧上升，贮藏15 d后质量损失率达到了8.57%，青椒果面凹陷皱缩严重，品质下降。而高湿组青椒果实的质量损失率随贮藏期的延长缓慢上升，贮藏15 d后质量损失率为2.24%，仅为低湿组果实的26.14%，差异显著（P＜0.05）。硬度是衡量果实贮藏品质的重要指标之一。如图2B所示，在整个贮藏期间，青椒果实的硬度呈不断下降的趋势，但高湿组较低湿组下降缓慢，且在6 d后两组呈现出显著差异（P＜0.05）。这些结果表明高湿贮藏可以降低青椒果实水分损失的速率，从而保持其商品性，延长货架期。

图2 高湿贮藏对青椒果实冷藏期间质量损失率（A）和硬度（B）的影响Fig.2 Effect of high relative humidity storage on mass loss percentage (A)and firmness (B) of green pepper fruits during cold storage

2.3 高湿贮藏对青椒果实叶绿素、抗坏血酸、总酚和总黄酮含量的影响

图3 高湿贮藏对青椒果实冷藏期间叶绿素（A）、抗坏血酸（B）、总酚（C）、总黄酮（D）含量的影响Fig.3 Effect of high relative humidity storage on the contents of chlorophyll (A), ascorbic acid (B), total phenolics (C) and total flavonoids (D)in green pepper fruits during cold storage

如图3A所示，在整个贮藏期内，青椒果实的叶绿素含量呈现出逐渐下降趋势，贮藏6～9 d期间低湿组的叶绿素含量迅速下降，而高湿组下降缓慢，贮藏结束高湿组的叶绿素含量显著高于低湿组（P＜0.05）。抗坏血酸、酚和黄酮是青椒中重要的抗氧化物质。如图3B所示，在贮藏期间低湿组和高湿组的青椒果实抗坏血酸含量均呈下降趋势，而低湿组的抗坏血酸含量下降得更快，幅度更大。在贮藏结束时，低湿组和高湿组的抗坏血酸含量分别为贮藏开始时的48.90%和69.29%，两组之间差异显著（P＜0.05）。如图3C、D所示，在贮藏期内，青椒果实中总酚和总黄酮含量呈现出先上升后下降的趋势，且高湿组的含量始终高于低湿组，贮藏15 d后，高湿组青椒果实的总酚和总黄酮含量与低湿组相比分别提高了17.88%和17.99%。这些结果表明，高湿贮藏可保持青椒果实较高的叶绿素、抗坏血酸、总酚和总黄酮含量，从而减轻冷害造成的品质劣变。

2.4 高湿贮藏对青椒果实抗氧化酶活力的影响

如图4A、D所示，低湿贮藏的青椒果实在整个贮藏期内的SOD和APX活力变化幅度很小，而高湿贮藏则促进了青椒果实前期的SOD和APX活力的上升，且均在第9天达到峰值，分别是同期低湿组的1.34 倍和1.32 倍，差异显著（P＜0.05）。如图4B所示，青椒果实在4 ℃贮藏期间，低湿组和高湿组青椒果实CAT活力呈先上升后下降趋势，且均在第9天达到最大值，分别为98.41 U/mg和124.93 U/mg，在峰值出现之前高湿组青椒果实的CAT活力显著高于低湿组（P＜0.05）。如图4C所示，高湿组青椒果实的POD活力在贮藏前期急速上升，而低湿组上升较为缓慢，两组均在贮藏9 d时达到最大值，此时高湿组青椒果实的POD活力比低湿组高41.09%。两组在贮藏9 d后差异显著（P＜0.05）。这些结果表明，高湿贮藏保持了青椒果实较高的抗氧化酶活力，有利于活性氧的清除。

图4 高湿贮藏对青椒果实冷藏期间抗氧化酶SOD（A）、CAT（B）、POD（C）和APX（D）活力的影响Fig.4 Effect of high relative humidity storage on antioxidant enzyme SOD (A), CAT (B), POD (C) and APX (D) activities in green pepper fruits during cold storage

2.5 高湿贮藏对青椒果实生成速率和H2O2含量的影响

图5 高湿贮藏对青椒果实冷藏期间·生成速率（A）和H2O2含量（B）的影响Fig.5 Effect of high relative humidity storage on · generation rate(A) and H2O2 content (B) in green pepper fruits during cold storage

2.6 高湿贮藏对青椒果实DPPH自由基清除率和羟自由基清除率的影响

图6 高湿贮藏对青椒果实冷藏期间DPPH自由基（A）和羟自由基（B）清除率的影响Fig.6 Effect of high relative humidity storage on DPPH radical scavenging activity (A) and hydroxy radical scavenging activity (B) in green pepper fruits during cold storage

如图6A所示，低湿组和高湿组青椒果实的DPPH自由基清除率在贮藏期内的变化趋势相同，均在前3 d短暂降低后升高，在第9天达到峰值，随后又下降。贮藏结束时高湿组的DPPH自由基清除率比低湿组高71.91%，两者差异显著（P＜0.05）。如图6B所示，青椒果实的羟自由基清除率在整个贮藏期间呈先上升后下降趋势，贮藏6 d后高湿组青椒果实的羟自由基清除率显著高于低湿组（P＜0.05）。这些结果表明，高湿贮藏可维持青椒果实较高的自由基清除能力。

3 讨 论

冷藏是果蔬采后最重要的保鲜手段，但青椒是一种冷敏性果实，不适宜的低温贮藏会造成青椒的生理代谢失调和组织伤害，即产生冷害，严重影响采后青椒的贮藏寿命和冷链流通[6]。因此，如何延缓或减轻冷害的发生是青椒果实冷链贮运的关键。本研究发现在普通低湿冷库中贮藏的青椒果实贮藏期间冷害指数上升较快，15后表现出严重的果面凹陷和花萼褐变而失去商品价值。而采用干雾控湿冷库高湿贮藏可显著减轻果实的失水软化及冷害症状，至贮藏结束时冷害指数仅为37.04%，比低湿组低54.54%。同时高湿贮藏还可维持青椒果实较高的叶绿素、抗坏血酸、总酚和总黄酮含量，从而保持较好的营养品质和商品价值。这与贾雯茹等[16]采用干雾控湿高湿冷库贮藏减轻黄瓜果实冷害的结果相似。另外采用塑料薄膜包装从而创造的高湿环境也可减轻番茄[9]和脐橙[10]的冷害。这些结果表明，高湿度的贮藏环境有利于减轻冷敏性果实的冷害，延长贮藏期。

抗坏血酸、酚类物质和类黄酮是青椒中重要的非酶抗氧化成分，与果实的抗冷性密切相关。CaiYuting等[28]的研究证明，茉莉酸甲酯处理可维持果实中较高的抗坏血酸含量，是减轻枇杷冷害褐变的原因之一。Lo’ay等[29]发现，外源抗坏血酸处理也可减轻香蕉的冷害褐变。孙玉洁等[30]发现甜菜碱处理能提高枇杷果实总酚和总黄酮含量，有助于清除活性氧，抑制膜脂过氧化，从而减少果实冷害的发生。在本研究中，干雾控湿高湿贮藏可提高青椒果实中抗坏血酸、总酚和总黄酮含量，保持较高的DPPH自由基和羟自由基清除率，并可显著抑制冷害指数的上升。这些结果表明，高湿贮藏可通过维持抗氧化系统中较高的抗坏血酸、总酚、总黄酮等抗氧化物质的含量来减轻青椒果实的冷害。

SOD、CAT、POD和APX是果蔬抗氧化系统中主要的抗氧化酶。SOD通过歧化反应清除•，并生成H2O2和O2，CAT将H2O2进一步分解成H2O和O2，POD和APX则分别催化酚类物质和抗坏血酸与H2O2反应从而清除[31]。这4 种酶协同作用来维持果蔬体内活性氧代谢的平衡。当冷敏性果蔬遭受低温胁迫后，抗氧化系统的活性下降，活性氧代谢平衡被打破，高浓度的活性氧加速膜脂中不饱和双键发生过氧化作用，膜系统的结构和功能遭到破坏，从而引起膜透性的增大及细胞代谢的紊乱，最终导致冷害的发生[32-33]。已有研究表明抗氧化系统中抗氧化酶活性也与冷敏果实的抗冷性有关。如采用茉莉酸甲酯处理枇杷后可显著提高果实体内抗氧化酶SOD、CAT和APX的活性，抑制•和H2O2的产生，减轻了果实的冷害症状[34]。采用外源甘氨酸甜菜碱处理可诱导青椒果实POD、CAT和APX的基因表达，提高抗氧化系统的活性，抑制了冷害的发生[6]。本研究发现，高湿贮藏能诱导SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶活力的增加，增强DPPH自由基和羟自由基清除率，抑制•和H2O2的积累。这些结果表明，高湿贮藏条件下较高的抗氧化酶活性可有效清除活性氧，防止其对细胞膜系统的伤害，进而减轻贮藏期间青椒果实冷害的发生。

综上，本研究表明，干雾控湿高湿贮藏可显著抑制青椒果实冷害指数、相对电导率和质量损失率的上升以及叶绿素、抗坏血酸、总酚和总黄酮等营养物质含量的下降，从而维持良好的采后品质。同时，高湿贮藏还可诱导抗氧化系统中SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶活力上升，保持较高的DPPH自由基和羟自由基清除率，从而抑制•和H2O2的积累，延缓膜脂过氧化作用，减少果实冷害的发生，因而在青椒果实冷链贮运中具有较好的应用前景。