LncRNA Mirt2通过调控MKP-1/JNK通路保护心肌细胞避免缺氧复氧损伤*

申 健，李梦豪，邓焕堂，李志明，何丽珍，张 宇，罗艳芳，谢雄伟，刘锦光

广东省惠州市中心人民医院心血管内科，惠州 516001

急性心肌梗死是全球范围内最常见的心血管危重症之一，其发病后出现心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[1-2]。心肌缺血/再灌注损伤是一个非常复杂的病理生理过程，可导致严重的急性和慢性心肌损伤[3]。心肌缺血再灌注过程中，除了细胞坏死外，细胞凋亡也是导致细胞死亡的另一个重要原因[4]。此外，还证实了该过程中会出现炎症反应[4-5]。因此，减少细胞凋亡和炎症反应可能对探究缺血/再灌注损伤的分子机制，寻找预防心肌缺血/再灌注损伤的治疗方法具有重要意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类竞争性的内源性RNA，由于缺乏完整的开放读码框架而缺乏蛋白质编码功能。研究证实LncRNA在急性心肌梗死患者中存在差异表达[6-8]。LncRNA心肌梗死相关转录因子2(myocardial infarction-associated transcript 2，Mirt2)是一种新发现的LncRNA，其抗炎活性已在现有研究中得到证实[9]。研究结果显示Mirt2可抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症通路激活，并在巨噬细胞极化反应中作为一个重要的调节因子出现[10]。c-Jun氨基末端活化蛋白激酶(Jun kinase enzyme，JNK)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MAP kinase phosphatase，MKP-1)在大鼠心肌细胞炎症损伤中发挥重要作用[11-12]。然而，Mirt2在心肌细胞缺血再灌注中的作用及与MKP-1/JNK信号通路的关系目前仍不清楚。

本研究通过构建H9C2心肌细胞缺氧复氧模型来模拟心肌细胞缺血再灌注损伤，采用脂质体转染技术过表达Mirt2，探究其对心肌细胞炎症因子表达和细胞凋亡的影响，进一步探讨Mirt2在心肌缺血再灌注中的作用及其机制，为临床预防和治疗心肌损伤提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

大鼠心肌细胞H9C2购于中国科学院上海细胞库。培养液(DMEM)、胎牛血清(FBS)、无糖培养液、缓冲液(PBS)、链霉素/青霉素双抗购于美国Gibco公司。

1.2 临床样本

收集广东省惠州市中心人民医院急性心肌梗死患者和正常人血液样本各10例，分析LncRNA Mirt2在急性心肌损伤患者血液中的表达水平变化。

1.3 实验分组

H9C2心肌细胞分组4组：对照组；缺氧复氧组，缺氧2 h，复氧12 h；过表达对照组，缺氧复氧的细胞转染Mirt2过表达对照载体；Mirt2过表达组，缺氧复氧的细胞转染Mirt2过表达载体。

1.4 细胞培养

将购买的H9C2细胞复苏，接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入含10%FBS的DMEM培养液。置于37℃细胞培养箱中培养，隔天换新的培养液。细胞密度达到90%时，用胰酶消化液将H9C2细胞消化下来，进行传代培养。取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.5 细胞转染

采用脂质体转染法将LncRNA Mirt2 mimics和阴性对照(过表达对照载体)转染入H9C2细胞中。

1.6 qRT-PCR检测LncRNA Mirt2的表达及转染效率

收集血液和细胞样本。采用Trizol提取血液和细胞中的RNA。根据逆转录试剂盒的说明书操作步骤进行逆转录合成cDNA。采用以下程序：在50℃下进行反转录2 min，在94℃下初始变性2 min，然后45次循环，温度为95℃，持续15 s，55℃持续1 min，72℃持续5 s。采用SYBR混合试剂盒，用lightcycler 2.0(Roche)进行qRT-PCR检测。

1.7 CCK-8法检测细胞活力

分组处理后，将细胞培养于96孔板中，加入10 μL CCK-8试剂在每个孔中与培养液混合，37℃下反应1 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.8 Caspase-3活性检测

将细胞接种于24孔板中，根据Caspase-3活性分析试剂盒说明书进行实验操作，检测各组细胞中Caspase-3活性的变化。

1.9 TUNEL染色法分析细胞凋亡

将细胞接种在6孔板中，培养12 h后，加PBS清洗2次，根据TUNEL检测细胞凋亡操作步骤，分析细胞凋亡情况。

1.10 Western blot检测蛋白表达

用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。采用BCA试剂盒测定上述提取蛋白的浓度。随后，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离不同分子量的蛋白质，并将其转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用脱脂奶封膜过夜。孵育一抗PARP、Cleaved PARP、pro-Caspase-3、Cleave Caspase-3、IL-1β、IL-6、MKP-1、t-JNK、p-JNK、t-c-Jun、p-c-Jun(均购自Abcam公司)及GAPDH，4℃冰箱过夜。取出后，室温下，用二抗孵育1 h。洗膜后，加化学发光试剂，显影。采用Image J软件进行蛋白定量分析。

1.11 酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbenta assay，ELISA)实验

将细胞接种在24孔板中，收集细胞培养上清进行分析。采用酶联免疫吸附试剂盒检测IL-1β和IL-6的浓度，按照产品操作说明进行。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 Mirt2在急性心肌损伤患者中的表达水平

qRT-PCR结果显示，Mirt2在急性心肌损伤患者血液样本中的表达下调，与正常健康对照相比，Mirt2表达水平显著降低(P<0.05，图1)。

2.2 Mirt2在缺氧复氧心肌细胞中的表达及转染验证

qRT-PCR结果表明，Mirt2在缺氧复氧后H9C2细胞中的表达下调，与对照组相比，Mirt2的表达水平显著降低(P<0.05，图2A)；与过表达对照组相比，Mirt2过表达组的Mirt2水平显著升高(P<0.05，图2B)。以上结果证实Mirt2在缺氧复氧心肌细胞中表达减少，过表达Mirt2效率明显。

图1 Mirt2在急性心肌损伤患者中的表达(n=10)Fig.1 Expression of Mirt2 in patients with acute myocardial injury(n=10)

A:Mirt2在缺氧复氧后表达下调;B:Mirt2过表达组Mirt2水平显著高于过表达对照组图2 Mirt2在缺氧复氧心肌细胞中的表达及转染验证Fig.2 Mirt2 expression and transfection validation in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.3 过表达Mirt2对缺氧复氧心肌细胞炎性因子的影响

Western blot检测结果显示，H9C2心肌细胞在缺氧复氧条件下，IL-1β和IL-6的蛋白表达显著增加，与过表达对照组相比，Mirt2过表达可以显著减少炎性因子IL-1β和IL-6的蛋白表达(均P<0.05，图3A)。ELISA检测结果显示，H9C2心肌细胞缺氧复氧条件下，IL-1β和IL-6的释放显著增加(均P<0.05)，与过表达对照组相比，Mirt2过表达可以显著减少炎性因子IL-1β和IL-6的释放(均P<0.05，图3B)。以上结果表明在缺氧复氧心肌细胞中过表达Mirt2可以保护细胞，减轻炎性反应。

A:Western blot;B:ELISA实验;1：对照组；2：缺氧复氧组；3：过表达对照组；4：Mirt2过表达组；与对照组比较，*P<0.05；与过表达对照组比较，#P<0.05图3 Mirt2过表达对缺氧复氧心肌细胞炎性因子的影响Fig.3 Effects of Mirt2 overexpression on inflammatory factors in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.4 过表达Mirt2对缺氧复氧心肌细胞活力和凋亡的影响

CCK-8检测结果表明，与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧复氧后细胞活力显著降低；与过表达对照组相比，Mirt2过表达可以增加细胞的活力(均P<0.05，图4A)。Caspase-3试剂盒检测结果显示，与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧复氧后细胞中Caspase-3的活性显著增加；与过表达对照组相比，Mirt2过表达组细胞中Caspase-3的活性显著降低(均P<0.05，图4B)。TUNEL染色结果显示，与对照组相比，缺氧复氧组心肌细胞凋亡数量增加；与过表达对照组相比，Mirt2过表达组的心肌细胞凋亡数量显著减少(均P<0.05，图4C、4D)。这些结果表明过表达Mirt2可以提高心肌细胞活力，保护心肌细胞避免缺氧复氧损伤。

A:心肌细胞活力;B:Caspase-3活性;C、D:心肌细胞凋亡；1：对照组；2：缺氧复氧组；3：过表达对照组；4：Mirt2过表达组；与对照组比较，*P<0.05；与过表达对照组比较，#P<0.05图4 Mirt2过表达对缺氧复氧心肌细胞活力和凋亡的影响Fig.4 Effect of Mirt2 overexpression on the viability and apoptosis of hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.5 过表达Mirt2对缺氧复氧心肌细胞凋亡蛋白表达的影响

Western blot蛋白检测结果显示，与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧复氧后细胞中Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白显著增加，与过表达对照组相比，过表达Mirt2减少了Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达(均P<0.05，图5)。以上结果表明过表达Mirt2可以减少缺氧复氧心肌细胞凋亡蛋白的表达，保护细胞的活力。

1：对照组；2：缺氧复氧组；3：过表达对照组；4：Mirt2过表达组；与对照组比较，*P<0.05；与过表达对照组比较，#P<0.05图5 Mirt2过表达对缺氧复氧心肌细胞凋亡蛋白表达的影响Fig.5 Effect of Mirt2 overexpression on apoptosis proteins in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.6 过表达Mirt2对缺氧复氧心肌细胞中MKP-1/JNK通路的影响

Western blot蛋白检测结果显示，t-JNK、t-c-Jun的表达在各组之间无差异。与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧复氧后细胞中MKP-1蛋白表达显著减少，p-JNK、p-c-Jun蛋白表达显著增加；与过表达对照组相比，过表达Mirt2增加了MKP-1蛋白表达，减少了p-JNK、p-c-Jun的蛋白表达(均P<0.05，图6)。以上结果表明过表达Mirt2可能通过影响MKP-1/JNK通路在缺氧复氧心肌细胞发挥保护作用。

1：对照组；2：缺氧复氧组；3：过表达对照组；4：Mirt2过表达组；与对照组比较，*P<0.05；与过表达对照组比较，#P<0.05图6 Mirt2过表达对缺氧复氧心肌细胞凋亡蛋白的影响Fig.6 Effect of Mirt2 overexpression on apoptosis proteins in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

3 讨论

急性心肌梗死(AMI)是一种常见的致死性疾病，威胁着全球人民的生命健康[13]。及时再灌注是抢救缺血心肌的关键[14]。尽管再灌注可以保护缺血心肌免受不可避免的死亡，但它有副作用，造成缺血/再灌注(I/R)损伤。最近研究发现LncRNA参与缺血/再灌注的心肌细胞损伤过程[15-16]。因此，需要进一步探究LncRNA与缺血/再灌注心肌细胞损伤的发病机制。

炎症反应是一个复杂的过程，涉及细胞因子、趋化因子、血管生成因子和其他介质的协同作用[17]。缺血再灌注后的炎症反应被认为与转录因子NF-κB的激活有关，转录因子NF-κB可刺激多种炎症介质的表达，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8[18-19]。因此，限制这些炎症介质对治疗心肌缺血再灌注可能是有益的。我们研究发现，H9C2心肌细胞在缺氧复氧条件下，IL-1β和IL-6的蛋白表达和浓度显著增加，与过表达对照组相比，Mirt2过表达可以显著减少炎性因子IL-1β和IL-6的蛋白表达和释放。因此，过表达Mirt2可以抑制炎症反应，在缺血再灌注中发挥保护作用。

心肌损伤后心肌细胞凋亡是一个与缺氧复氧相关的持续的动态过程[20]。减少心肌细胞凋亡被认为是治疗心肌缺血再灌注损伤的有效治疗策略[21]。在我们的研究中，过表达Mirt2增加了缺氧复氧心肌细胞的活性，减少了心肌细胞凋亡。同时，过表达Mirt2对凋亡相关蛋白的表达也产生影响。过表达Mirt2减少了Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达。以上结果表明过表达Mirt2可以减少缺氧复氧心肌细胞凋亡蛋白，保护细胞的活力。

MKP-1是双特异性磷酸酶的成员，对ERK1/2、JNK和p38 MAPK活性负调控[22]。据报道，它参与调节LPS反应，并抑制促炎性细胞因子的分泌[23]。一项研究发现miR-101可以抑制MKP-1的表达以延长巨噬细胞中MAPKs的激活[24]。此外，JNK被发现可以调节LPS诱导的MKP-1的产生[25]。Kim等[26]发现谷氨酰胺通过激活MKP-1和抑制LPS处理的HDPCs中的NF-κB和MAPK途径发挥抗炎作用。众所周知，MKP-1/JNK通路在细胞增殖、活性和凋亡的生物学过程中发挥重要作用，同时有研究报道其与炎症反应也存在密切关系[27]。我们研究发现H9C2心肌细胞缺氧复氧后细胞中MKP-1蛋白表达显著减少，p-JNK、p-c-Jun的蛋白显著增加，与过表达对照组相比，过表达Mirt2增加了MKP-1蛋白表达和减少了p-JNK、p-c-Jun的蛋白表达。因此，Mirt2在缺氧复氧心肌细胞损伤中通过MKP-1/JNK通路发挥作用。

综上所述，本研究发现LncRNA Mirt2参与心肌缺氧复氧损伤过程，发挥抗炎症和保护心肌细胞的作用。因此，调控Mirt2表达可以在一定程度上为心肌缺血再灌注损伤提供新的治疗策略。