特异性抗体P210减轻Ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤*

陈 娟，王志文，魏宇淼

华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科，武汉 430022

动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程，其特征是在早期形成脂质条纹，然后发展成斑块。随着脂质条纹的形成，内皮功能发生障碍，单核细胞粘附，氧化应激，泡沫细胞形成，血管平滑肌增殖，胶原蛋白沉积和血小板活化[1]。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)及其脂质成分引起的内皮激活或功能障碍已被证明在动脉粥样硬化的发病机制中起着至关重要的作用[2]。

低密度脂蛋白(LDL)在氧化过程中，脂质和载脂蛋白B100(ApoB100)均被修饰。活性氧会导致ApoB100断裂，从而产生14 kD至500 kD的肽，胆固醇酯、磷脂和三酰甘油中的多不饱和脂肪酸也经过自由基引发的氧化作用，产生了各种各样的较小片段[3]。大量研究表明针对Ox-LDL及其ApoB100的片段进行疫苗接种对动脉粥样硬化具有保护作用[4-6]。其中特异性片段P210在ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中的保护作用尤其明显[7-8]，已被用于动脉粥样硬化的疫苗接种[9]。由此可见，免疫干预可能是预防和治疗动脉粥样硬化的有效方法，但目前关于Ox-LDL及其载脂蛋白片段的疫苗接种对动脉粥样硬化的具体保护机制尚不明确。因此本研究拟通过构建体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型，研究根据ApoB100肽段P210制作的特异性抗体对Ox-LDL诱导内皮细胞及内皮连接屏障损伤的影响及其可能的机制，为该抗体用于临床预防和治疗动脉粥样硬化提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

HUVEC由教育部分子靶向治疗重点实验室(心血管免疫实验室)提供。人单核细胞THP-1购自广州吉妮欧生物科技有限公司。DMEM培养液购于中国源培公司，RPMI-1640培养液和血清购于美国Gibco公司，胰蛋白酶购于Amreso公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)、低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)、血管内皮钙粘蛋白(VE-Cadherin)、紧密连接蛋白(Occludin)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)抗体均购于Abcam公司。荧光探针Dil标记的氧化低密度脂蛋白(Dil-Ox-LDL)购于武汉安特捷生物有限公司。牛血清白蛋白、油红染液、DAPI染液、钙黄绿素-Am(Calcein-Am)染液购于武汉赛维尔生物科技有限公司，BCA法蛋白定量试剂盒和Western blot凝胶试剂盒均购于中国碧云天生物科技有限公司，RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)购于武汉安特捷生物有限公司，ApoB100特异性多肽片段及其特异性抗体的制备提纯由武汉安特捷生物有限公司辅助完成，5%脱脂牛奶、甲醇等辅助试剂购于武汉赛维尔、安特捷生物有限公司。

1.2 细胞培养及分组

THP-1培养于含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中。选择生长状态良好的THP-1细胞用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)诱导24～48 h，使其分化为具有吞噬功能的巨噬细胞。HUVEC培养于含有FBS的DMEM培养液中。两种细胞均置于21%O2、5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。根据细胞生长密度进行传代及培养。将对数生长期状态良好的HUVEC以约1×106/mL的密度接种于6孔板中，分为3组，即对照组、Ox-LDL组、Ox-LDL+Ab组。部分实验组中还设有不同浓度的亚组。

1.3 蛋白提取及浓度测量

弃去6孔板内培养液，用PBS轻轻晃洗2遍，每孔加入70～100 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，冰上孵育10 min后用细胞刮收集细胞至1.5 mL EP管中，4℃ 12000 r/min离心15 min后吸取上清，根据BCA蛋白定量试剂盒设置标准孔与样本孔，测得蛋白浓度。蛋白质上样量为20 μg或25 μg，将蛋白质与5×蛋白上样缓冲液混合配成20 μL或者25 μL体系，99℃煮10 min，-80℃冰箱长期保存或用于下一步实验。

1.4 Western blot检测细胞连接屏障及炎症因子的蛋白表达情况

根据Western bolt凝胶试剂盒说明书配制好分离胶及浓缩胶，以20 μg或25 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，根据Marker指示切下目的蛋白以及内参所在区域的凝胶，湿法转膜至PVDF膜。适量封闭液浸没PVDF膜，摇床上封闭2 h，封闭完后用TBST轻轻晃洗。按照1∶1000的比例配制好GAPDH、β-actin、LOX-1、VE-Cadherin、Occludin、MCP-1、VCAM-1一抗，加入适量一抗置于冰盒内摇床过夜，第2天用TBST清洗膜3次，每次10 min，清洗完后加入用5%脱脂牛奶稀释的二抗，比例为1∶3000，常温反应2 h后TBST清洗。按1∶1比例配制ECL发光液，均匀淋在PVDF膜上，应用凝胶成像分析系统曝光，分析图片。

1.5 利用Transwell小室共孵育观察内皮及内皮下脂质沉积及抗体的保护作用

我们借鉴改进Transwell小室模型来模拟血管内膜及内膜下单核巨噬细胞用于动脉粥样硬化的研究。采用0.4 μm Transwell小室，上层紧密种植内皮细胞层，通过HE、Calcein-AM活体细胞荧光染色以及多聚甲醛固定后DAPI染色来观测内皮细胞连接及细胞形态。下层均匀稀疏种植经PMA诱导的THP-1来源的巨噬细胞。以红色荧光探针Dil标记的Ox-LDL作为刺激，用激光共聚焦检测抗体对内皮细胞内脂质沉积及内膜下脂质蓄积的影响。小室下层巨噬细胞油红O染色进一步间接验证透过内皮细胞层的脂质蓄积情况。观察特异性抗体对这一过程的影响。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 特异性抗体可以减轻Ox-LDL透过内皮细胞侵入内膜下形成脂质蓄积

Transwell实验设计思路如图1：小室(0.4 μm孔径)上层紧密接种内皮细胞(HE染色、Calcein-Am活体染色及4%多聚甲醛固定后DAPI染色)，下层均匀接种人THP-1来源的巨噬细胞(油红O染色及4%多聚甲醛固定后DAPI染色)。以此模拟内皮层及内膜下巨噬细胞，研究内皮细胞脂质浸润及内皮间隙受损后Ox-LDL浸润至内皮下的情况。

图1 Transwell实验设计思路图Fig.1 Experimental design of Transwell

结果如图2所示，Ox-LDL组经Ox-LDL诱导24 h后，红色荧光探针Dil标记的Ox-LDL可被小室上层内皮细胞(4%多聚甲醛固定后DAPI染色)吞噬，沉积于细胞内，特异性抗体作用24 h后，内皮细胞内的红色探针较Ox-LDL组明显减少，说明特异性抗体可以减少内皮细胞内脂质蓄积。

图2 P210抗体减轻内皮细胞内脂质沉积(DAPI染色，×200)Fig.2 Reduced lipid deposition in endothelial cells by P210 antibody(DAPI staining，×200)

如图3所示，经Ox-LDL诱导24 h后，红色荧光探针Dil标记的Ox-LDL可透过小室上层的内皮细胞间隙被小室下层的巨噬细胞(4%多聚甲醛固定后DAPI染色)吞噬，抗体作用24 h后，巨噬细胞内的红色探针较对照组明显减少，说明特异性抗体可以减少Ox-LDL透过内皮细胞浸入内膜下形成脂质蓄积。

2.2 特异性抗体下调Ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1的表达以保护内皮连接

如图4所示：体外培养HUVEC，随机分为3组，每组各设1个复孔，分为对照组、Ox-LDL(50 μg/mL)组、Ox-LDL(50 μg/mL)+Ab(100 ng/mL)组，分别检测各组LOX-1、VE-Cadherin、Occludin的表达。经Ox-LDL(50 μg/mL)诱导24 h后，血管内皮细胞LOX-1的表达较对照组明显增多(P<0.01)，VE-Cadherin、Occludin的表达较对照组明显减少(均P<0.01)，抗体作用24 h后，与Ox-LDL诱导组对比，LOX-1的表达下降，VE-Cadherin、Occludin的表达增多(均P<0.01)。说明Ox-LDL诱导后引起LOX-1的表达上调，抑制内皮紧密连接蛋白和血管内皮钙粘蛋白表达，抗体作用后可显著抑制这一效应，减轻内皮细胞连接屏障的损伤，保护内皮连接。

与对照组比较，**P<0.01；与Ox-LDL组比较，##P<0.01图4 P210抗体对Ox-LDL诱导的LOX-1、VE-Cadherin、Occludin蛋白表达的影响Fig.4 Effects of P210 antibody on protein expressions of LOX-1，VE-Cadherin and Occludin in Ox-LDL-induced cells

2.3 特异性抗体可减少Ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性分子的表达

结果如图5所示，体外培养HUVEC，随机分为3组，即对照组，Ox-LDL组、抗体组。Ox-LDL组又分为2个不同浓度(50 μg/mL，100 μg/mL)的亚组，诱导24 h后，与对照组比较，MCP-1、VCAM-1的蛋白表达增多，且随Ox-LDL的浓度增高而增高；抗体组在Ox-LDL(50 μg/mL)的刺激下加入不同浓度(100 ng/mL、200 ng/mL)的抗体作用24 h后，被Ox-LDL诱导升高的MCP-1、VCAM-1蛋白表达水平有所降低，且随抗体浓度的增高MCP-1、VCAM-1的蛋白表达水平降低得更为明显。

①：对照组；②：50 μg/mL Ox-LDL组；③100 μg/mL Ox-LDL组；④50 μg/mL Ox-LDL+100 ng/mL Ab组；⑤50 μg/mL Ox-LDL+200 ng/mL Ab组；与①组比较，**P<0.01；与③组比较，#P<0.05 ##P<0.01图5 P210抗体对Ox-LDL诱导的MCP-1、VCAM-1蛋白表达的影响Fig.5 Effects of P210 antibody on protein expressions of MCP-1 and VCAM-1 in Ox-LDL-induced cells

3 讨论

血管壁细胞内脂质沉积和血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生的关键机制。LDL可被单核细胞、巨噬细胞表面的LDLR所识别并吞入胞内被溶酶体降解，LDLR与前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)之间的动态平衡维持着细胞内胆固醇水平相对稳定[10]。在血管壁细胞中，LDL被氧化修饰后，与LDLR的结合位点丢失，且产生大量的氧化反应特异性表位[11]，使得单核细胞、巨噬细胞通过清道夫受体(SRs)，如B型Ⅰ类清道夫受体(SR-BI)、B型清道夫受体CD36等，吞噬Ox-LDL，而清道夫受体不受细胞内脂质浓度的负反馈调节[12]，大量脂质进入细胞内且胆固醇外流受阻，导致细胞内大量脂质沉积。本研究利用Transwell小室模型来检测内皮细胞及巨噬细胞内脂质蓄积，实验结果显示：Ox-LDL诱导24 h后，Ox-LDL可被Transwell小室上层的内皮细胞吞噬，还可透过细胞间隙浸润至小室下层被巨噬细胞吞噬，特异性抗体包被后可显著抑制这一效应，表明该抗体可减少氧化脂质在内皮细胞和巨噬细胞内的蓄积，减少泡沫细胞的产生，从而抑制动脉粥样硬化的发生发展。

Ox-LDL可刺激VCAM-1、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达，使得单核细胞粘附于内皮细胞，还可刺激内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞分泌MCP-1，使得单核细胞向内皮下迁移，从而加剧动脉粥样硬化的进展。本研究检测Ox-LDL诱导内皮细胞24 h后炎性因子的表达，实验结果显示：Ox-LDL诱导24 h后，炎性因子VCAM-1、MCP-1的表达较对照组明显增多，而特异性抗体作用后，VCAM-1、MCP-1的表达明显下降，说明该抗体可以通过减少炎性因子的分泌来减少单核细胞向内皮细胞的粘附以及向内皮下的迁移，从而减轻内皮细胞的损伤，抑制动脉粥样硬化的发生发展。

在血管内皮细胞，Ox-LDL仅被LOX-1特异性识别、吞噬、降解，结合后可刺激活性氧(ROS)表达增加，同时，Ox-LDL与LOX-1结合还可通过诱导ROS表达增加来激活核因子κB(NF-κB)通路[13]。Ox-LDL还通过LOX-1激活精氨酸酶Ⅱ，从而导致内皮细胞中一氧化氮合酶的下调，导致内皮功能障碍[1]。内皮细胞通过LOX-1吞噬Ox-LDL造成内皮细胞脂质蓄积及氧化应激，内皮细胞屏障功能受损，突出表现为细胞紧密连接蛋白(ZO-1)及Occludin、VE-Cadherin的表达及功能受损[14]。本研究检测Ox-LDL诱导内皮细胞24 h后LOX-1、VE-Cadherin、Occludin的表达量，实验结果显示：经Ox-LDL诱导24 h后，LOX-1的表达较对照组明显升高，内皮屏障连接蛋白VE-Cadherin、Occludin的表达较对照组明显下降，而特异性抗体作用后，LOX-1表达下调，内皮屏障功能得到改善。

综上所述，本研究表明，特异性抗体对内皮细胞具有保护作用，主要体现在减少脂质蓄积、下调LOX-1表达、保护内皮连接屏障和减少炎性因子的分泌这些方面。可能的机制是抗体与Ox-LDL结合，避免其向内皮细胞的粘附，阻断其被巨噬细胞和内皮细胞吞噬，减轻内皮细胞脂质应激和氧化应激，减轻内皮细胞损伤和连接屏障损害，但这一机制尚不明确，仍需通过进一步的细胞实验和动物实验进行探索，而本实验证明的特异性抗体P210对减少内皮细胞和巨噬细胞内氧化脂质的蓄积以及对血管内皮连接屏障的保护作用，为预防和治疗动脉粥样硬化提供了可能的方向。