HPV16 E6基因变异通过调控BDNF/TrKB表达促进宫颈癌细胞增殖的研究

孙丽艳，杨宾烈，张 爱，原杰彦，陶萍萍

(上海市浦东新区人民医院妇产科，上海 201200 )

宫颈癌是导致全球范围内女性死亡的第四大原因，仅中国就有13.5万例新病例登记在案，其中死亡病例占发病人数的50 %左右[1,2]。人乳头状瘤病毒(HPV)是感染宫颈癌最重要的危险因素[3]，其中HPV16 E6过表达可使肿瘤蛋白53(p53)和视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)失活阻碍细胞凋亡，诱导细胞增殖及抑制细胞凋亡[4-8]。有研究表明，HPV16 E6变异对宫颈癌发展进程有重要影响，尤其是HPV16 E6 L83V(T350G)突变能可通过降解p53加速宫颈癌的恶化[9]，然而其分子机制还未明确。有研究表明，受体酪氨酸激酶B(TrKB)在恶性肿瘤的形成和转移中起着重要的作用，TrKB与其配体脑源性神经营养因子(BDNF)的结合可促进上皮间质转化、细胞增殖等过程，并且可激活磷脂酰肌醇3激酶/丝/苏氨酸激酶(PI3K/AKT)通路[11]，进而活化鼠双微体2(MDM2)，MDM2作为p53的负性调节因子可使p53失活[12,13]。本课题前期研究已表明HPV16 E6基因中的T178G、T350G和A442C变异与HPV16持续感染有关，并且HPV16 E6 T350G可能有更高的锥切术后HPV16复发及持续感染相关性[13-15]。此外，TrKB和BDNF在宫颈癌及癌旁组织中的表达呈显著差异[16,17]，以及初步探索了HPV16 E6与p53、Rb的表达关系[18,19]。综上所述，根据前期研究及已有报道，笔者提出HPV16 E6 T350G对宫颈癌进程的调控可能通过调控BDNF/TrkB表达，以及影响PI3K/AKT信号通路及下游分子p53表达有关，并且目前没有文章表明上述分子之间的靶向调控关系，因此本课题具有一定的创新性。本课题将通过组织检测与体外实验，探究HPV16 E6变异对宫颈癌细胞增殖能力的影响及相关分子机制。本项目的实施将为临床治疗宫颈癌提供一定的理论基础，具有重要的理论意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人宫颈上皮细胞(HCerEpiC)(中国科学院上海细胞生物学研究所)、LV5-HPV 16 L83V(T350G)过表达慢病毒(生工生物工程(上海)股份有限公司)、AKT抗体(Abcam)、p-AKT抗体(Abcam)、p-PI3K抗体(Abcam)、PI3K抗体(Abcam)、TrKB抗体(Abcam)、BDNF抗体(Abcam)、羊抗兔IgG(Abcam)、内参抗体GAPDH(Abcam)、内参抗体β-actin(Abcam)、ECL发光液(7 Sea biotech)、TRIpure总RNA提取试剂(北京百泰克)、Super M-MLV反转录酶(北京百泰克)、酶标仪(ELX-800，BIOTEK)、荧光定量PCR仪(Exicycler 96，BIONEER)、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天)、—70℃超低温冰箱(DW HL-668)、引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 宫颈癌组织标本

收集上海市浦东新区人民医院2017年4月～2018年2月宫颈浸润癌IA 1期～IB 2期行广泛全子宫切除术后宫颈组织10例和因宫颈上皮内瘤变Ⅱ级(CIN Ⅱ)行LEEP术切除宫颈组织10例，患者35～63岁，中位年龄51岁，术前均未接受放化疗。标本组织经过3位有经验的病理科医师进行诊断，所有患者经书面知情同意参与本研究。且通过医院伦理委员会批准。标本收集后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 细胞培养及转染

HCerEpiC细胞用含有10 %胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5 % CO2的培养箱内培养。调整HCerEpiC细胞状态，HPV16 E6 T350G慢病毒过表达载体(pLV5-HPV16 E6 T350G)及对照(pLV5-vector)，选择对数生长期细胞进行转染，以HCerEpiC细胞(control)作为对照。

1.4 Real-time PCR

称取30～100 mg宫颈癌组织及CINⅡ宫颈组织，液氮冷冻后进行研磨操作，利用总RNA提取试剂及cDNA合成试剂提取细胞总RNA并反转录至cDNA，放入ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量反应，采用2-△△CT法对ECRG4 mRNA进行定量分析。引物序列如下，β-actin-F:5'-GGAAATCGTGCGTGACATC AA-3'，β-actin-R：CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA；HPV16 E6 T350G-F:5'-TATAAAACTAAGGGCGTAAC-3'，HPV16 E6 T350G-R:5'-CATGCAATGTAGGT GTATCT-3';BDNF-F:5'-TGCGGGAGGAATTTCTGAGT-3'，BDNF-R: 5'-CTTAA AGCACGAGGTCC-3';TrKB-F:5'-CTGGCCTGGAATTGACGATG-3',TrKB -R：5'-ACCACAGCATAGACCGAGAG-3';p53-F:5'-TGCGTGTGGAGTATTTGATG- 3',p53-R:5'-TGGTACAGTCAGAGCCAACCTC-3'。

1.5 Western Blot

取各组细胞，提取蛋白，绘制蛋白标准曲线。取15～30 μg进行SDS-PAGE电泳。转PVDF膜后，封闭后加入一抗(兔抗BDNF、TrKB、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT均1∶500稀释)4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，加入二抗(羊抗兔IgG-HRP，1∶10 000稀释)37 ℃孵育40 min。孵育ECL发光液，静置5 min，暗室曝光后显影、定影，扫描胶片采集灰度值，分析目标条带光密度值。

1.6 MTT细胞增殖实验

细胞转染后，将浓度为0.2 mg/mL MTT，96孔板每孔加入20 μL，每组设置3个副孔，同时设置空白孔。培养4～6 h，弃上清，每加入150 μL DMSO，水平摇床上震荡，formazan结晶颗粒全部溶解后停止。570 nm测定吸光度，存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100 %。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 CINⅡ宫颈组织与宫颈癌组织各基因mRNA表达检测结果

Real-time PCR实验结果表明与CINⅡ宫颈组织相比，宫颈癌组织中HPV16 E6 T350G表达呈阳性，以及TrKB与BDNF mRNA表达也呈明显上调趋势(P<0.01)，此外p53表达呈阴性(P<0.01)。见表1。

表1 CINⅡ宫颈组织与宫颈癌组织中相关基因表达量的比较

2.2 HPV16 E6 T350G基因过表达结果

将HPV16 E6 T350G慢病毒表达载体(pLV5-HPV16 E6 T350G)及空载体对照(pLV5-vector)转染HCerEpiC细胞后，Real-time PCR结果表明pLV5-HPV16 E6 T350G组细胞中HPV16 E6 T350G mRNA水平(6.92±0.10)与pLV5-vector组(1.08±0.02)相比显著上调(P<0.01)，表明转染实验成功，可用于后续实验。

2.3 HPV16 E6 T350G对HCerEpiC细胞BDNF/TrKB表达的影响

将pLV5-HPV16 E6 T350G及pLV5-vector转染HCerEpiC细胞后，Real-time PCR及Western Blot结果表明，HPV16 E6 T350G在HCerEpiC细胞中表达上调后，会显著增强BDNF与TrKB mRNA及蛋白表达水平(P<0.01)，表明在宫颈癌中BDNF/TrKB可能作为HPV16 E6 T350G变异的下游调控分子。见表2。

表2 HPV16 E6 T350G对各组细胞BDNF/TrKB mRNA及蛋白表达量的影响

2.4 HPV16 E6 T350G对HCerEpiC细胞PI3K/Akt信号通路及p53表达的影响

将pLV5-HPV16 E6 T350G及pLV5-vector转染HCerEpiC细胞后，Western Blot结果表明，HPV16 E6 T350G在HCerEpiC细胞中表达上调后，会上调PI3K与Akt 磷酸化水平(P<0.01)，说明HPV16 E6 T350G可能通过BDNF/TrKB激活宫颈癌细胞中PI3K/Akt信号通路。此外，Real-time PCR实验结果表明HPV16 E6 T350G的上调能够明显降低p53表达水平(P<0.01)。见表3。

表3 HPV16 E6 T350G对各组细胞PI3K/Akt信号通路及p53表达的影响

2.5 HPV16 E6 T350G对HCerEpiC细胞增殖能力的影响

将pLV5-HPV16 E6 T350G及pLV5-vector转染HCerEpiC细胞后，MTT实验结果表明HPV16 E6 T350G的过表达能够增强HCerEpiC细胞的增殖能力。见表4。

表4 HPV16 E6 T350G对各组细胞增殖能力的影响

3 讨论

宫颈癌作为全球范围内高发病率妇科恶性肿瘤之一，严重影响女性的正常生活及身心健康。HPV作为感染宫颈癌的重要因素，其变异对宫颈癌的发展起着不可忽视的作用[5]。HPV是具有双链环状基因组的非胞膜DNA病毒，包含6个早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和两个晚期基因(L1、L2)[6,20]。HPV家族根据DNA序列同源性可分为5个属，其中α属(α-HPV)中的高风险α-HPV(HR-HPVS)是宫颈癌与肛门生殖器癌等疾病的致病因子。因HPV感染引起的99.7 %宫颈癌中，HR-HPVS是引起宫颈感染的主要原因，其中HPV16引发的感染占50 %，HPV16的E6与E7蛋白过度表达可通过引起细胞调节蛋白p53和Rb的失活阻碍细胞凋亡，诱导细胞增殖及转化[4-8]。其中，HPV16 E6变异在宫颈癌相关研究中被广泛关注，并且HPV16不同变异体育宫颈肿瘤癌变的相关性各不相同。HPV16变异体可分为欧洲型(E)、亚洲型(As)、亚美型(AA)和非洲型(Af)[21]。研究表明HPV16 E6氨基酸位点中的L83V(T350G)突变，被认定是HPV16使宫颈病变组织恶化的重要因素之一。此外，有研究表明HPV16 L83V 能加速p53的Bax蛋白降解从而抑制细胞凋亡能力，加强与E6结合蛋白(E6-BP)的结合能力[9]。

TrKB是一种跨膜蛋白，是BDNF的特异性受体，越来越多的证据表明TrKB在一些恶性肿瘤的形成和转移中起着重要的作用，TrKB可与其配体BDNF结合诱导多种信号级联，包括PI3K/AKT途径[22-24]。PI3K/AKT通路已成为多种抗癌药物耐药的主要驱动因素，p53作为其下游分子，该通路的激活可使p53失活，进而促进细胞的增殖能力，是癌细胞逃避程序性细胞死亡的常见机制[12,13]。

本研究结果表明，与CINⅡ宫颈组织相比，宫颈癌组织中HPV16 E6 T350G表达呈上调趋势，BDNF及TrKB也同样表达上调，说明在宫颈癌细胞中HPV16 E6 T350G可能通过增强BDNF/TrKB表达来影响宫颈癌发展进程。随后，通过在HCerEpiC细胞中过表达HPV16 E6 T350G，同样可以达到上调BDNF与TrKB mRNA及蛋白水平的结果。此外，笔者对BDNF/TrKB下游PI3K/AKT信号通路进行检测，结果表明，HPV16 E6 T350G的过表达可使PI3K与AKT磷酸化水平增高，说明HPV16 E6 T350G可使PI3K/AKT信号通路激活。最后，HPV16 E6 T350G的过表达可使p53表达下调，以及可以增强HCerEpiC细胞的增殖能力，该结果进一步阐明HPV16 E6 T350G对宫颈癌发展进程的影响。

综上所述，在宫颈癌细胞中HPV16 E6 T350G可能通过上调BDNF/TrKB表达促进PI3K/AKT信号通路的激活，使p53失活增强细胞增殖能力，进而促进宫颈癌疾病的发展与恶化。本研究明确了HPV16 E6 T35G基因变异对宫颈癌增殖的影响及其分子机制，为HPV16 E6 T350G在宫颈癌发展中的作用提供新的证据与靶点。