抑郁症大鼠内侧前额叶皮层PNNs表达及GABA能神经元功能改变

张宇昕，盖 聪，马浩洁，程翠翠，张锦坤，杨璐平，冯琬迪，周梦琪，赵海虹，胡 蝶，孙红梅

(北京中医药大学良乡校区中医学院，北京 102488)

抑郁症是一种高患病率、高复发率和高自杀率的慢性精神疾病[1]。大量基础和临床研究表明，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神经元功能异常在其中发挥重要作用[2]。神经元周围基质网络(perineuronal nets, PNNs)是一种主要包绕在小清蛋白(parvalbumin, PV)阳性(PV+)GABA能神经元周围的细胞外基质[3]，研究发现PNNs结构异常参与多种神经精神疾病的发病过程[4]，然而其在抑郁症中的作用目前尚不明确。因此，本研究拟通过慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictability mild stress，CUMS)建立抑郁动物模型，检测大鼠内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex, mPFC)脑区PNNs水平，及其主要组分蛋白聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、短小蛋白聚糖(Brevican)和GABA主要合成酶谷氨酸脱羧酶67(glutamic acid decarboxylase 67，GAD67)的表达水平，探讨应激对PNNs及GABA能神经元功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型制备

健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠28只(220～240 g)，由北京维通利华公司提供。实验前动物适应性饲养1周，随机分为对照组和模型组，每组14只。模型组大鼠给予4周CUMS建立抑郁症模型[5]，每天随机选取一种长应激(禁水24 h、禁食24 h、拥挤24 h、倾斜24 h、持续光照24 h)和一种短应激(冷水游泳5 min、夹尾60 s、束缚2 h、频闪4 h、白噪音4 h)，同种应激不连续出现，防止动物产生适应性。对照组不做任何处理。28 d后进行行为学检测。每组4只用于免疫荧光实验，10只用于检测蛋白表达。

1.2 行为学检测

1.2.1糖水偏爱实验[6](sucrose preference test，SPT) 采用该实验考察应激是否导致大鼠出现快感缺失症状。测试分为两个阶段：适应阶段，第1天给予大鼠2瓶1%糖水适应24 h，第2天给予1%糖水和纯水各1瓶，12 h后调换位置；测试阶段，第3天1%糖水和纯水各1瓶称重后给予大鼠，24 h后称重，计算糖水偏爱值和总饮水量。糖水偏爱值=糖水摄入量/(糖水摄入量+纯水摄入量)×100%。总饮水量=(糖水摄入量+纯水摄入量)(mg)/体重(g)。

1.2.2新颖环境抑制摄实验[7](novelty inhibited feeding test，NSFT) 采用该实验考察应激是否导致大鼠出现焦虑样行为。大鼠禁食24 h后在长75 cm、宽75 cm、高45 cm的旷场中进行测试。旷场中央放置几粒食物，将动物放入旷场角落，记录大鼠的摄食潜伏期，若10 min内大鼠未开始摄食，则摄食潜伏期以600 s计。测试结束后将大鼠放入饲养笼(熟悉环境)中自由摄食，记录5 min内食物消耗量反映大鼠食欲，食物消耗量=摄食重量(mg)/体重(g)。

1.2.3强迫游泳实验[6](forced swimming test，FST) 采用该实验考察应激是否导致大鼠出现绝望行为。强迫游泳实验在直径20 cm、高50 cm的透明玻璃缸中进行，水深30 cm，水温±25℃。大鼠游泳时，需保证其四肢或尾巴不能触及桶底。实验第1天进行15 min游泳适应，第2天(24 h后)进行5 min的强迫游泳测试，记录大鼠的漂浮不动时间。

1.3 免疫荧光实验

检测PNNs密度及PNNs和PV双标阳性(PNNs+PV+)神经元占PV+神经元百分比。每组4只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，使用PBS灌注，再用4%多聚甲醛灌流固定，取脑后放入4%多聚甲醛后固定1 d，再先后置于20%和30%的蔗糖溶液中梯度脱水。脱水后取mPFC脑组织20 μm冷冻切片，每次收集相距300 μm的脑片(每15张脑片取1张)以避免对同一细胞重复测量，每组至少选取5张脑片用于统计[8]。PBS洗5 min×3次，置于多花紫藤的凝集素(1∶200，Sigma Aldrich)和Anti-Parvalbumin antibody(1∶500，Sigma Aldrich)封闭液溶液中行免疫荧光双标，4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，室温孵育置于Fluoro TagTMFITC偶联试剂盒(1∶200，Sigma Aldrich)和Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)(1∶500，Abcam)封闭液溶液3 h，PBS洗5 min×3次，封片。在荧光显微镜下观察并采用image J软件计数并分析mPFC脑区PNNs密度以及PNNs+PV+神经元占PV+神经元百分比。

1.4 Western blot实验

检测Aggrecan、Brevican及GAD67蛋白表达。每组10只大鼠断头取脑，正己烷骤冷20 s取出，存于-80℃。选取mPFC脑区进行脑组织匀浆，匀浆后4℃下静置30 min、离心10 min，取上清继续离心30 min后取上清液。用BCA法测定蛋白含量，采用SDS-PAGE凝胶电泳，每道加20 μg蛋白，电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜，分别加入Aggrecan(1∶1 000，Abcam)、Brecican(1∶1 000，Abcam)、GAD67(1∶5 000，Abcam)、β-actin(1∶2 000，Proteintech)抗体孵育4℃过夜，洗脱一抗后孵育相应的二抗(1∶5 000，北京中杉金桥)1 h，ECL荧光法显色，应用Image J软件进行定量分析。实验组的数值比相应的对照组数值，得到比值为最终表征蛋白水平的数据[6]。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 24.0进行统计分析，采用独立样本t检验，检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 行为学结果

模型组糖水偏爱率较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.01)，但两组的总饮水量无统计学差异(P=0.17)；模型组的摄食潜伏期较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)，但两组5 min内食物消耗量无统计学差异(P=0.59)，提示CUMS对大鼠的食欲无影响；模型组5 min内大鼠漂浮不动时间较对照组延长，差异有统计学意义(P<0.01)。各项行为学指标均表明模型组产生抑郁与焦虑样行为，提示抑郁症模型造模成功。见表1。

表1 各组大鼠行为学数据

2.2 免疫荧光结果

与对照组比较，PNNs及PNNs+PV+神经元占 PV+神经元百分比均下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2及图1。

表2 免疫荧光表达情况

图1 PNNs、PV+神经元及其PNNs + PV+表达情况Fig 1 The expression of PNNs, PV+ neurons and their PNNs+ PV+

2.3 western blot结果

模型组PNNs组分蛋白Aggrecan、Brevican，GABA合成酶GAD67水平较对照组均下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、3及表3。

图2 相关蛋白表达情况

注：与对照组比较，**P<0.01。图3 各组分蛋白分析比较Fig 3 Analysis and comparison of each component protein

表3 各组蛋白水平

3 讨论

本研究结果显示，与对照组相比，4周CUMS导致大鼠mPFC脑区PNNs密度及PNNs+PV+神经元占PV+神经元百分比明显下降，且PNNs的主要组分蛋白Aggrecan、Brevican的表达量也下调。此外，研究观察抑郁模型大鼠mPFC脑区内GABA的主要合成酶GAD67含量变化，模型组较对照组GAD67的蛋白表达降低。本研究成果提示CUMS诱导的抑郁模型大鼠发病与mPFC脑区PNNs水平及GABA能神经元功能密切相关。

mPFC脑区功能异常与抑郁症、精神分裂症等多种精神疾病密切相关，其体积减少也是抑郁症中最有据可查的异常之一[9]。mPFC功能障碍与压力引起的认知和情感缺陷有关，且mPFC的神经元萎缩和突触结构及功能的改变与抑郁症的发病机制密切相关[10]。在啮齿类动物中，mPFC损伤的大鼠较正常大鼠应激易感性增加，且产生抑郁焦虑样行为[11]。本研究发现大鼠mPFC脑区内PNNs组分蛋白及GABA合成酶表达水平变化，进一步证明了mPFC是CUMS诱导的抑郁模型的关键脑区。

PNNs是细胞外基质中的一种特殊结构，广泛存在于中枢神经系统，在神经元之间、神经胶质细胞之间以及神经元和神经胶质之间的信号传递过程中发挥关键作用[12]。PNNs异常参与了多种神经精神疾病的发病过程，如慢性压力导致青春期大鼠mPFC脑区PNNs密度降低[6, 13]，PNNs的重要组分Aggrecan和以聚集蛋白聚糖高度代表的6-硫酸化硫酸软骨素(CS-6)链异常可导致精神分裂症及双向情感障碍易感性增加[14]。这些研究及本研究结果均提示CUMS诱导的抑郁模型大鼠发病与mPFC脑区PNNs水平降低密切相关。

PNNs主要包裹在PV+的GABA能神经元周围，发挥保护和缓冲外界应激的作用[15, 16]。因此，PNNs水平下降可能导致GABA能神经元对应激等刺激更为敏感，导致神经元功能异常。GAD作为GABA的主要合成酶，特异性的表达在GABA能神经元中，在抑郁症患者和长期处于压力状态的动物大脑观察到GABA和GAD67水平降低[17]。在精神分裂症等精神疾病中也发现PNNs水平下降，以及GABA能回路破坏[18]。上述研究及本研究均提示CUMS诱导的抑郁症大鼠PNNs减少可能导致GABA能神经元功能损伤。

但本研究也存在一定的局限性，例如免疫荧光检测样本量较少，可能影响研究结果的准确性。因此，在进一步研究中将增加样本量，以及探讨降解PNNs后大鼠的行为学改变和对GABA能神经元功能的影响。

综上所述，本研究从基础研究的角度探讨mPFC脑区中PNNs水平减低及GABA能神经元功能异常与慢性应激导致的抑郁相关，为抑郁症研究提供了新的思路。本研究也为抑郁症治疗提供了新思路，关于抗抑郁症药物对PNNs的影响也可在进一步研究中继续分析。

所有作者声明此项研究不存在潜在利益冲突关系。