基于网络药理学探究杏仁-桔梗药对治疗急性支气管炎的作用机制研究

蔡申燕，石佳勇，骆天炯

(1.南京中医药大学,江苏 南京 210029；2.南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210022)

急性支气管炎(acute bronchitis)是由微生物感染、物理刺激、化学刺激或过敏因素等引起的支气管黏膜急性炎症，临床表现以持续1～3周的急性咳嗽为主[1]。咳嗽目前已成为内科门诊患者就诊时最常见的主诉之一，而急性支气管炎作为咳嗽的主要病因尤为常见[2]。且急性支气管炎一旦失治，必会转变为慢性支气管炎[3]，迁延难愈，严重危害患者身体健康与生活质量，也给社会经济造成一定负担。急性支气管炎在中医学中属“咳嗽病”范畴[1]，而早在《黄帝内经》时期中医就有了针对咳嗽的专篇论述[4]，治疗经验丰富，值得进一步的深入挖掘研究。

杏仁、桔梗均为历代中医名家治疗肺系疾病的常用药物，常配伍应用于外感咳嗽[5]、肺纤维化[6]、咳嗽变异性哮喘[7]等疾病，也频繁出现在急性支气管炎的治疗指南中[1，8，9],是止咳的经典药对。其中杏仁味苦性温，归肺、大肠经，有降气、止咳平喘、润肠通便的功效，常用治咳逆上气、喘促、久病大肠燥结不利等；桔梗味苦、辛，归肺经，可宣肺利咽、祛痰排脓，常用治痰嗽喘急、胸满、喉痹咽痛等。杏仁善通降肺气，桔梗善升提肺气，二者配伍，升降调和，既可宣肺化痰，又能降气止咳平喘，有助于肺的宣降功能恢复正常。从现代医学角度来说，急性支气管炎的本质是支气管黏膜的急性炎症，现有的一些研究亦证明了杏仁中的苦杏仁苷[10]、桔梗中的桔梗皂苷[11]等化学成分在抗炎方面有一定作用。但每一味中药都包含着丰富的有效成分，每种有效成分又有着多种不同的作用靶点，中药的疗效并不是某种单一成分的作用，而是多成分、多靶点共同作用的结果，需全面整体地来看待。

网络药理学(network pharmacology)是一门从系统层面揭示中药对机体调控网络作用的新兴学科，通过构建“药物-有效成分-靶点-疾病”之间的复杂网络关系来预测药物的作用机制[12，13]。它改变了传统的“一个靶点，一种疾病，一个药物”的研究模式，以“多靶点、多通路、多成分”代之，与中医学中的“整体观念”有异曲同工之妙。近年来，网络药理学越来越多地应用于中医药领域，成为研究中药单药或复方治疗疾病作用机制的新方法。本研究试通过网络药理学研究方法，探讨“杏仁-桔梗”药对治疗急性支气管炎的可能分子作用机制，为中医药治疗急性支气管炎的后续研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 “杏仁-桔梗”药对所含化学成分的搜集

本研究基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以关键词分别检索杏仁、桔梗的全部化学成分。

1.2 活性化学成分的筛选及对应靶点的搜集

本研究以以下条件对所有搜集到的化学成分进行筛选：口服利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18。筛选出具有较高活性的化学成分作为候选化学成分，并在TCMSP平台搜集候选化学成分对应的潜在靶点。

1.3 疾病靶点的确定

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、在线《人类孟德尔遗传》数据库(OMIM，https://omim.org)搜集急性支气管炎(acute bronchitis)的疾病相关靶点。

1.4 作用靶点的筛选及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建

利用R语言“VennDiagram”数据包筛选药物潜在靶点和疾病相关靶点的交集，并将交集的靶点数据上传至String数据库(https://string-db.org)构建PPI图，根据Degree值筛选出核心靶点。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

将药物的活性成分和筛选的交集靶点上传至Cytoscape3.7.0软件生成化学药物-成分-靶点-疾病网络图，并通过网络拓扑结构分析得出关键的化学成分和靶点。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析和基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

使用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，设定阈值P<0.05，筛选“杏仁-桔梗”药对治疗急性支气管炎的主要作用通路。

2 结果

2.1 “杏仁-桔梗”药对所含化学成分的搜集结果

通过TCMSP分别搜集中药杏仁、桔梗所包含的化学成分，得到杏仁113个，桔梗102个。

2.2 活性化学成分及相关靶点的筛选

将搜集到的化学成分以口服利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为筛选条件进行筛选，得到杏仁19个，桔梗7个，去重后共得到25个化学成分，为“杏仁-桔梗”药对的候选化学成分。另外，在TCMSP平台上搜集到候选化学成分的相应蛋白靶点共296个，经Uniprot标准化命名，去重后得到127个。

2.3 疾病靶点的确定

通过GeneCards数据库搜集到急性支气管炎的疾病靶点1 440个，在线《人类孟德尔遗传》OMIM数据库搜集到疾病靶点176个，去重后共得到1 593个。

2.4 作用靶点的筛选及PPI网络图的构建与分析

利用OmicShare网站韦恩图分析筛选出“杏仁-桔梗”药对的潜在靶点和急性支气管炎的疾病相关靶点的交集靶点共81个，见图1。将这些靶点上传至String网站进行靶点间的蛋白互作分析，置信度设定为大于0.4，构建PPI网络，见图2。在PPI网络图中，共有81个节点，1 168条边，平均Degree为28.8，网络节点代表靶点蛋白，线条代表蛋白之间的联系。并利用R语言计算各靶点Degree，绘制Degree排名前20的核心靶点柱状图，见图3。其中Degree排名前3位的核心靶点有AKT1、TP53、MAPK1等。

图1 杏仁-桔梗-急性支气管炎靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of the targets of almond-platycodon-acute bronchitis

图2 靶点蛋白—蛋白相互作用网络图Fig 2 Target protein-protein interaction network

图3 核心靶点柱状图Fig 3 Histogram of core targets

2.5 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

利用Cytoscape3.7.0软件将25个化学成分、81个靶点、杏仁(XR)、桔梗(JG)和急性支气管炎(AB)构建药物-成分-靶点-疾病网络图，见图4。网络图中共包含102个节点(18个化学成分节点，81个靶点节点，2个药物节点，1个疾病节点)和284条边，有7个化学成分与疾病无关联，未参与网络构建。图中绿色代表药物，黄色代表单独成分，橙色代表共有成分，蓝色代表靶点，红色代表疾病。运用网络拓扑结构分析后得出各节点Degree值，Degree排名较前的化学成分是：木犀草素(luteolin)、刺槐素(acacetin)、光甘草定(Glabridin)、甘草查尔酮B(Licochalcone B)、豆甾醇(Stigmasterol)。Degree排名较前的靶点是：PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2。以上可能是“杏仁-桔梗”药对发挥治疗作用的关键化学成分和作用靶点。也体现了“杏仁-桔梗”药对多成分、多靶点治疗急性支气管炎的特点。

图4 药物-成分-靶点-疾病相互作用网络Fig 4 Network diagram of the drug-composition-target-disease

2.6 GO功能富集分析和 KEGG通路富集分析

将上述交集靶点导入DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用OmicShare绘制高级气泡图，获得423条GO功能条目(P<0.05)，包括322条生物过程(图5)，42条细胞组分(图6)和59条分子功能(图7)，其中关联的生物过程主要有凋亡过程负调控、细胞增殖正调控、一氧化氮合成正调控等。KEGG通路富集分析获得100条信号通路(P<0.05)，主要涉及细胞凋亡、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等，见图8。

图5 “杏仁-桔梗”靶点的GO生物过程富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of biological processes of the targets of “almond- platycodon”

图6 “杏仁-桔梗”靶点的GO细胞组成富集分析Fig 6 GO enrichment analysis of cell components of the targets of “almond- platycodon”

图7 “杏仁-桔梗”靶点的GO分子功能富集分析Fig 7 GO enrichment analysis of molecular functions of the targets of “almond- platycodon”

图8 “杏仁-桔梗”靶点的KEGG通路富集分析 Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis of the targets of “almond- platycodon”

3 讨论

中华中医药学会早在2008年就发布了关于急性支气管炎的中医治疗指南[8]，根据其咳嗽咳痰等主要临床变现将其归于中医肺系疾病“咳嗽”范畴。肺主皮毛，开窍于鼻，又为娇脏，不耐寒热，易感外邪而发病。六淫外邪或烟尘等秽浊之气从皮毛及口鼻而入侵袭人体，首先犯肺，肺气为邪所困宣降失常，可内生痰邪，肺气挟痰上逆，即发为咳嗽咳痰。故该病的基本病机为肺失宣肃、肺气上逆，治疗原则应以宣降肺气止咳为主[1]。“杏仁-桔梗”历来是止咳祛痰、调畅气机的常用药对，《景岳全书》中的桔梗杏仁煎、《温病条辨》中的桑菊饮、杏苏散等经典名方，以及目前市售的感冒清热颗粒、川贝止咳糖浆等中成药中均包含这一药对，应用范围十分广泛，涵盖风寒、风热、风燥、痰热等多种常见证型。本研究通过网络药理学研究方法，试探讨“杏仁-桔梗”治疗急性支气管炎过程中发挥疗效的可能分子机制，为临床相似疾病的治疗及中成药新药的研发开拓思路。

本研究通过对杏仁、桔梗有效成分的分析，构建了药物-成分-靶点-疾病网络。网络中的关键化学成分为木犀草素、刺槐素、光甘草定、甘草查尔酮B、豆甾醇。木犀草素、刺槐素是桔梗的活性成分，光甘草定、甘草查尔酮B、豆甾醇是杏仁的活性成分。其中木犀草素在网络中的Degree值(50)远超其他化学成分(刺槐素21、光甘草定16、甘草查尔酮B15、豆甾醇 14)，可推断是“杏仁-桔梗”药对在治疗急性支气管炎中发挥疗效的最关键成分。

木犀草素是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性作用。木犀草素的抗炎作用主要通过调节炎症介质(抑制IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα、IFN-β等促炎因子，提高IL-10等抑炎因子的水平，并抑制趋化因子)和改变NF-κB、MAPK等信号通路来完成[14]。据现有研究显示，木犀草素对金黄色葡萄球菌[15]、化脓隐秘杆菌[16]等革兰氏阳性菌，H1N1[17]、COVID-19[18]、EV71[19]等病毒均有一定抑制效果。刺槐素、光甘草定与木犀草素同属黄酮类，药理活性有一定相似之处，同样具有良好的抗炎杀菌活性[20-21]。实验证明，刺槐素可以降低过敏性哮喘小鼠的气道高反应性、嗜酸性粒细胞浸润和肺组织杯状细胞增多[22]，并对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌都具有很强的抑制活性[23]，对流感病毒也有一定抑制作用[24]。光甘草定除对结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等有良好的抗菌活性外[25]，还可诱导白色念珠菌的凋亡[26]。甘草查尔酮B可通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用[27]。豆甾醇属植物甾醇类，亦有显著的抗炎活性，已被证实对骨关节炎[28]、结肠炎[29]等有一定治疗效果。由此可见，“杏仁-桔梗”中的多种主要化学成分均有明确的抗炎、抗菌、抗病毒等作用，适用于急性支气管炎的临床治疗。

药物-成分-靶点-疾病网络分析显示：前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素内过氧化物合酶1(PTGS1)、维甲酸X受体α(RXRA)、β2肾上腺素能受体(ADRB2)等Degree值较高，是治疗急性支气管炎的关键作用靶点。PTGS又称环氧化酶(COX)，能够分解花生四烯酸产生各种内源性前列腺素，PTGS2是诱导型酶，受到炎症刺激时，其表达水平显著升高，在哮喘患儿中，气道黏膜中的单核-巨噬细胞等可激活产生大量的PTGS2，其可进一步诱导炎性细胞浸润，加重气道的炎症反应，引起呼吸困难[30]。PTGS1是结构型酶，在机体中表达相对稳定，主要功能是促进生理性前列腺素的合成。RXRA是配体依赖的核受体家族的重要成员,在炎症反应和代谢障碍中可能占据着至关重要的地位[31]。ADRB2属于鸟苷酸结合蛋白偶联受体，主要存在于支气管上皮、肺部免疫细胞中，可以通过调节β2肾上腺素能激动剂的活性，抑制气道平滑肌细胞的增殖以及炎性细胞的积累，在调控气道高反应和COPD的发展中扮演非常重要的角色[32]。由此可见，“桔梗-杏仁”药对可通过作用于PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2等靶点来改善呼吸道炎症。

基于STRING数据库构建的PPI网络，得到AKT1、TP53、MAPK1等是起到桥梁作用的核心靶点。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞代谢、增殖、凋亡等多种生物学过程，也是PI3K/AKT信号通路中的关键节点，在调节炎症反应方面扮演着重要角色[33]，可影响肺部及气道炎症[34]。TP53是一种肿瘤抑制因子，可调控细胞凋亡、细胞周期阻滞，肺泡Ⅱ型上皮细胞感染结核分歧杆菌的研究中，TP53协同p300抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化，负调控TNF-α等炎症因子的分泌[35]。丝裂原活化蛋白激酶MAPK1又称细胞外信号调节激酶ERK2，ERK1/2被激活后能介导多种生长因子和炎症介质,调控气道平滑肌细胞的增殖, 从而参与气道炎症和气道重塑[36]。

根据GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果显示，杏仁-桔梗药对作用靶点显著富集于细胞凋亡、PI3K-Akt、TNF以及T细胞受体等信号通路，发挥调控凋亡、细胞增殖、一氧化氮合成等生物学功能。细胞凋亡是细胞程序性死亡，气道上皮细胞过度凋亡，可破坏气道上皮完整性，进而破坏气道局部微环境稳态[37]。PI3K-Akt信号通路是参与细胞生长、增殖、分化调节的重要信号转导通路，在炎症、肿瘤、代谢等相关疾病的发病机制中起重要作用[38]。有实验证明，激活PI3K/Akt信号通路可诱导炎性因子的产生，从而促进呼吸道上皮细胞的炎症反应[39]。TNF-α与TNFR2结合可激活NF-κB信号通路,产生更多的炎症介质，增加炎症因子对气道的浸润，造成气道高反应[40]。T淋巴细胞是调节细胞免疫应答的重要细胞群，其中CD4+/CD8+是衡量免疫功能重要指标，支气管哮喘患者CD4+/CD8+明显下降[41]。

本研究采用网络药理学研究方法，试对“杏仁-桔梗”药对治疗急性支气管炎的多种作用靶点、作用通路及潜在机制做出探讨，为今后的进一步研究提供理论依据。研究结果显示，“杏仁-桔梗”中的木犀草素、刺槐素、光甘草定、甘草查尔酮B、豆甾醇等主要活性成分可能通过细胞凋亡、PI3K-Akt、TNF、T细胞受体等信号通路作用于PTGS2、PTGS1、AKT1、TP53等关键靶点，来发挥其抗炎、抗病毒、免疫调节等作用。曾有研究提出，“杏仁-桔梗”药对用于止咳、祛痰的最佳比例分别为1∶1和1∶2[42]，而此次研究未能将药对之间的剂量配比纳入考虑范围，具有一定局限性。希望今后能有更完善的理论及实验研究和临床疗效观察来对以上结论进行验证，为“杏仁-桔梗”治疗呼吸道急性炎症提供更有效的依据。