尿液细胞来源iPSCs-NSCs联合3D打印支架移植修复大鼠急性脊髓损伤的研究

李长明 邵荣学 邓小梅 赵士杰 王拓 全仁夫

急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI）是一种严重的中枢神经系统损伤，发病率和致残率均较高，常导致受损平面以下运动和感觉功能障碍[1]。ASCI 的主要损伤机制包括轴突的失连、神经细胞的凋亡与坏死等。目前尚无有效的方法治疗ASCI。近年来，组织工程学的兴起为ASCI 的治疗提供了新方向，并取得了不少进展[2-3]，其基本思路是生物支架+种子细胞原位移植于受损脊髓处，提供细胞再生的微环境及通路，以期重塑传导束及促进轴突再生。本研究通过对尿液细胞（urine cell，UC）进行重编程建立诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），并定向分化为神经干细胞（neural stem cells，NSCs），再将3D 打印支架载iPSCs 分化的NSCs 移植至受损脊髓，探讨3D 打印支架载UC 来源重编程iPSCs 分化的NSCs 对ASCI大鼠的疗效。

1 材料和方法

1.1 实验动物和标本 SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠42只，体重（200±10）g；SPF 级5 周龄雄性SD 小鼠14 只，体重（21±3）g；均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。均分笼饲养于屏障环境内，室温20～25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗交替的环境，自由摄食摄水。操作均严格遵守《实验动物管理条例》的相关规定。采集1 例23 岁健康成年男性的尿液作为实验标本，经杭州市萧山区中医院医学伦理委员会审批通过，患者签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（aladdin P133293）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（ab53554）、微管蛋白（β-tubulin Ⅲ）（ab52623）、生长相关蛋白43（GAP-43）（ab75810）、巢蛋白（Nestin）（OM264981）、FBS（F8687）均购于美国Sigma 公司；神经元特异性烯醇化酶（NSE）（bs-10445R）购于中国Bioss 公司；原代神经元细胞基础转染（Amaxa Basic Nucleofector）试剂盒（VPI-1003）购于德国Lonza 公司；ALP 检测试剂盒（KL-ALP-Ra）购于上海康朗生物科技有限公司；硫酸肝素（QC30767）购于美国GlpBio 公司；牛血清白蛋白（BSA）购于中国AMRESCO 公司；荧光显微镜（CKX53）购于日本Olympus 公司；冰冻切片机（CMll00）购于德国Leica 公司；高速冷冻离心机（HC-3018R）购于安徽中科中佳科学仪器有限公司；生物信号采集处理系统（medlab-1）购于南京卡尔文生物科技有限公司；3D 打印机购于杭州捷诺飞生物科技有限公司；冷场发射高分辨扫描电镜（S-4300）购于日本Hitachi 公司；可控性皮质损伤撞击仪（mode 6.3）购于美国Custom Design 公司；手术器械购于江苏鱼跃医疗设备股份有限公司。

1.3 UC 来源iPSCs 的分离及鉴定 UC 分离及构建iPSCs 参照Zhou 等[4]的方法。采集1 例23 岁健康成年男性尿液200 ml，进行细胞培养，按1∶2～1∶3 传代，取第3 代UC 进行转染，电转染使用原代神经元细胞基础转染试剂盒，培养6～10 d，待iPSCs 克隆出现（细胞出现聚集、核质比增大等变化），用玻璃针收集iPSCs 克隆并按1∶3～1∶5 进行传代。挑取克隆前1 d 接种饲养层细胞，在显微镜下，选取状态好的单克隆细胞用ALP 检测试剂盒进行ALP 活性检测（ALP 染色）。并将1×106个iPSCs 注入5 周龄雄性SD 小鼠背部皮下，HE 染色验证畸胎瘤的形成。iPSCs 使用4%多聚甲醛室温下固定15 min，0.25%（V/V）聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）/PBS 透膜10 min，室温下4%（W/V）BSA 封闭1 h。随后4 ℃下一抗孵育过夜，室温下二抗孵育30 min，以4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核。使用的一抗为抗OCT4（1∶350，兔多克隆）、抗NANOG（1∶1 000，兔单克隆）、抗TRA-1-81（1∶100，小鼠单克隆）、抗TRA-1-60（1∶100，小鼠单克隆）。二抗为山羊抗兔Alexa Fluor 488或568、山羊抗鼠Alexa Fluor 647。以DAPI 进行细胞核染色，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.4 iPSCs 向NSCs 的分化及鉴定 将消化下来的iPSCs 集落移至培养皿中，差速贴壁30 min，去除分化细胞及饲养层细胞，收集悬浮细胞集落，用拟胚体（EBs）培养基重悬，转移至细菌培养皿中悬浮培养，隔天换液；悬浮培养4 d 形成成熟的EBs；应用维甲酸+无血清培养基诱导，在EBs 培养基中诱导培养4 d，换成无血清培养基贴壁培养。筛选培养得到的神经球样克隆命名为iPSCs-NSCs。取诱导分化好的iPSCs-NSCs 置于含10%FBS 的培养基中培养，培养基先用0.1%明胶包被，采用免疫荧光检测β-tubulin Ⅲ和GFAP 表达。在培养板中将已爬好细胞的培养皿用4%多聚甲醛固定15 min，在培养皿内滴加5%BSA，37 ℃封闭30 min，移液枪吸掉封闭液，培养皿内滴加一抗Nestin（1∶200），4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗，移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加荧光二抗FITC（1∶100），37 ℃孵育45 min，PBS冲洗，滴加DAPI 避光孵育5 min 进行细胞核染色。PBS冲洗多余的DAPI，50%甘油封闭培养皿，荧光显微镜下观察iPSCs-NSCs 特异性标志物Nestin 的表达。

1.5 3D 打印硫酸肝素-胶原蛋白支架 采用3D 打印技术联合真空冷冻干燥法。取Ⅰ型胶原蛋白100 mg、Ⅱ型胶原蛋白10 mg 和硫酸肝素1 mg，加入PLGA 200 mg，充分混匀，增稠剂提高浆料的黏稠性与稳定性。打开氮气，将配制好的浆料置于物料桶内，设置好分压。选择打印针头并进行物料出料校准。设置与调节打印参数，包括出料温度、平台温度等。三维支架成型，室温下放置4 h 以上，45 与60 ℃分别恒温干燥箱中持续干燥12 h。电镜下观察支架形态。

1.6 支架细胞预处理 将3D 支架截成约2～3 mm 的小段，置于干细胞培养基中浸泡48 h 后，在无菌操作台中风干，灭菌备用。将iPSCs-NSCs 细胞培养至第7 天时，消化计数，将1×106个细胞浓缩为0.2 ml，滴于预处理过的支架上，置于培养箱中2 h 后用于实验。

1.7 实验动物分组 42 只8 周龄雄性SD 大鼠按照随机数字表法分为模型组、支架模型组和iPSCs-NSCs 组3 组，每组14 只。

1.8 ASCI 模型建立 采用改良Allens 法通过可控性皮质损伤撞击仪（mode 6.3）构建ASCI 模型。常规护理1 周后进行实验。大鼠麻醉后去除椎板，3 组均切除2～3 mm 长损伤处脊髓，给予不同干预措施。模型组于损伤处滴入DMEM 培养液0.2 ml，支架模型组于损伤处植入载DMEM 培养液的2～3 mm 支架，iPSCs-NSCs 组于损伤处植入载iPSCs-NSCs 的2～3 mm 支架。

1.9 观察指标

1.9.1 开放领域运动测试（basson beattle bresnahan,BBB）评分 干预1、2、4、6、8 周后，采用BBB 评分评价3 组大鼠关节协调功能，总分为21 分，分数越高，关节协调情况越好。

1.9.2 Tarlov 和Rivlin 评分 干预8 周后，采用Tarlov和Rivlin 评分评价3 组大鼠后肢运动功能，Tarlov 评分总分5 分，Rivlin 评分总分66 分，分数越高，后肢运动功能越好。

1.9.3 神经电生理检测 干预8 周后，采用生物信号采集处理系统（medlab-1）用电极针进行测定，给予直流方波电脉冲刺激，直至可刺激观察到后肢轻微抽搐为止，强度为7.5 V，波宽为0.2 ms，频率为3 Hz，叠加达到50 次。计算机叠加处理测试结果，记录运动、感觉诱发电位潜伏期长短和振幅的变化，观察神经电生理学情况。

1.9.4 病理检查 干预8 周后，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后开胸，自左心室插管至主动脉，然后剪开右心耳，先灌注PBS 150 ml，再用含4%中性多聚甲醛的0.9%氯化钠溶液250 ml 进行心脏灌注、固定。沿原手术正中切口，再次逐层暴露受损节段脊髓组织，切取原损伤区域胸段脊髓，石蜡包埋，连续5 μm 切片。HE 染色，光镜下观察3 组大鼠脊髓组织病理学改变情况。

1.10 统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐时，两两比较采用Tamhane's T2 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UC 来源iPSCs 构建 从尿液样本分离培养UC，结果显示第3 代UC 呈现纤维样或上皮样，状态良好（图1a，见插页）。ALP 染色显示，UC 来源iPSCs 克隆呈阳性（图1b，见插页）。畸胎瘤试验中，形成的畸胎瘤具有3 个胚层特征：软骨（中胚层）、肠上皮（内胚层）、神经上皮（外胚层）（图2）。表明UC 来源的iPSCs 在体内具有向3 个胚层分化的能力，进一步验证UC 来源iPSCs 的全能性。

图1 尿液细胞（UC）及诱导性多能干细胞（iPSCs）ALP 染色结果所见[（a：尿液中分离得到的第3 代UC，×25；b：UC 来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）ALP 染色呈阳性，×100）]

图2 畸胎瘤组织切片HE 染色所见[a：肠上皮（内胚层）；b：软骨（中胚层）；c：神经上皮（外胚层）；HE 染色，×200]

2.2 UC 来源iPSCs 的鉴定 免疫荧光检测显示，UC来源iPSCs 表达全能性蛋白OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60（图3，见插页），说明UC 来源iPSCs 呈全能性状态。

2.3 iPSCs-NSCs 鉴定 免疫荧光显示iPSCs-NSCs 中Nestin 目的蛋白呈现为绿色荧光，细胞核经DAPI 染色呈现蓝色荧光，结合上述细胞形态分析可以鉴定出细胞为iPSCs-NSCs（图4a，见插页）。免疫荧光显示βtubulin Ⅲ目的蛋白呈现为红色荧光，细胞核经DAPI 染色呈现蓝色荧光，细胞大量表达，分化能力良好（图4b，见插页）。免疫荧光显示GFAP 目的蛋白呈现为红色荧光，细胞核经DAPI 染色呈现蓝色荧光，细胞向周围延伸，分化能力良好（图4c，见插页）。

图3 诱导性多能干细胞（iPSCs）表达全能性蛋白免疫荧光标记结果（a：全能性蛋白OCT4 表达；b：全能性蛋白NANOG 表达；c：全能性蛋白TRA-1-81 表达；d：全能性蛋白TRA-1-60 表达；×200）

图4 诱导性多能干细胞（iPSCs）-神经干细胞（NSCs）中免疫荧光鉴定结果[a：iPSCs-NSCs 特征性标志物巢蛋白（Nestin）表达；b：iPSCs-NSCs 中微管蛋白（β-tubulin Ⅲ）表达；c：iPSCs-NSCs 中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达；×100]

2.4 3D 打印支架 3D 打印技术联合真空冷冻干燥法制造的3D 打印支架具有完美的内部三维立体多孔结构，扫描电镜显示支架横截面呈疏松的多孔状，孔径大小在50 μm 左右（图5）。

2.5 3 组大鼠BBB 评分比较 干预2、4、6、8 周后，iPSCs-NSCs 组大鼠BBB 评分均高于模型组和支架模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而模型组和支架模型组大鼠BBB 评分比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表1。

图5 3D 打印支架（a：3D 打印的支架；b-c：扫描电镜显示支架横截面呈疏松的多孔状，b×50，c×200）

表1 3 组大鼠BBB 评分比较（分）

2.6 3 组大鼠Tarlov 和Rivlin 评分比较 干预8 周后，iPSCs-NSCs 组大鼠Tarlov 和Rivlin 评分均高于模型组和支架模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而模型组和支架模型组大鼠Tarlov 和Rivlin 评分比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表2。

表2 3 组大鼠Tarlov 和Rivlin 评分比较（分）

2.7 3 组大鼠神经电生理检测结果比较 干预8 周后，iPSCs-NSCs 组大鼠运动和感觉诱发电位潜伏期均短于模型组和支架模型组，运动和感觉诱发电位振幅均大于模型组和支架模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而模型组和支架模型组大鼠运动和感觉诱发电位潜伏期、振幅比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表3。

表3 3 组大鼠神经电生理检测结果比较

2.8 3 组大鼠脊髓组织病理学改变比较 干预8 周后，HE 染色显示模型组大鼠脊髓组织受损，组织水肿明显，细胞稀疏（图6a）；支架模型组大鼠脊髓组织受损程度轻于模型组，组织水肿，细胞稀疏（图6b）；iPSCs-NSCs 组大鼠脊髓组织生长良好，细胞致密，空泡减小，组织水肿消失（图6c）。

3 讨论

本研究发现，ASCI 大鼠经UC 来源重编程iPSCs-NSCs 联合3D 支架移植治疗后，BBB 评分、Tarlov 和Rivlin 评分均明显升高，提示UC 来源重编程iPSCs-NSCs 联合3D 打印支架移植可明显改善大鼠神经功能的恢复。ASCI 后造成上下行神经传导束中断及微环境受损是ASCI 后截瘫的根源。因此，如何促进上下行神经传导束连接及微环境的修复是治疗ASCI 的重点。近年来组织工程技术为ASCI 的治疗提供了新的思路：良好的生物相容性及合理的支架设计可以为受损轴突提供桥梁，种子细胞依附于桥梁上并增殖，为促进脊髓神经功能的恢复提供了良好的基础。本研究创新性地利用3D 打印支架将种子细胞修饰后移植于受损脊髓处，结果表明3D 打印支架+iPSCs-NSCs 联合能明显促进大鼠运动、感觉功能的恢复和神经元的恢复。

NSCs 是一种多能干细胞，有永久的增殖能力及分化多向性，是理想的种子细胞。NSCs 可分化成星型胶质细胞、少突胶质细胞和神经元，具有神经营养、免疫调节和修复的作用，能促进感觉和认知功能恢复，在治疗神经系统疾病中的前景较好[5]。但既往研究中，NSCs多来源于人类胎儿组织或者胚胎干细胞[6-7]，受到伦理学限制难以在临床中广泛应用。随着iPSCs 的出现，研究者们发现iPSCs 可以作为NSCs 的来源，并且在动物实验中发现iPSCs-NSCs 同样可以改善ASCI 后运动功能障碍，iPSCs-NSCs 移植到大鼠脊髓受损区域后，在该区域大部分分化成神经元，但是这项技术仍然受制于iPSCs 本身提取效率的低下[8]。虽然目前iPSCs 可以从多种细胞[9-12]中通过重编程获得，但是大部分方法取样是损伤性的，导致收集样本较困难。Zhou 等[4]报道人UC可被诱导为iPSCs，具有无创、费用低的优点。这些细胞大部分保留正常的功能且容易获得，是进行体外研究的理想细胞来源。因此本研究收集UC 作为细胞来源，诱导iPSCs，并进行畸胎瘤检测及全能性蛋白免疫荧光检测，证实了UC 来源iPSCs 具有与胚胎干细胞相似的全能性。本体外实验中，NSCs 的特征性标志物Nestin表达，证实了iPSCs 向NSCs 的成功分化。GFAP 和βtubulin 分化良好，说明本实验成功将UC 重编程为iPSCs，并诱导UC 来源iPSCs 分化为NSCs。

图6 干预8 周后各组大鼠HE 染色结果所见[a：模型组；b：支架模型组；c：诱导性多能干细胞（iPSCs）-神经干细胞（NSCs）组；HE 染色，×100]

生物支架在治疗中应确保种子细胞保留在脊髓损伤部位，调节微环境及填充病变腔并诱导其定向生长[13]。传统支架多采用高温烧制和模型注塑，精度难以掌控，且不能随意改变支架的孔隙。近年来3D 打印技术可以通过设置不同参数打印不同规格的支架，且具有成型迅速、个性化需求及规模量产等优点[14-15]。3D 打印支架为中空多孔的结构，为上下行传导束的重建和轴突生长提供通道并除去物理隔离，对改善受损组织物理微环境有着积极的作用；本研究打印的支架孔隙约为50 μm，不仅可以提供细胞的依附场所，还可以提供细胞增殖的空间。既往研究证实生物支架+种子细胞具有较好的相容性，能促进大鼠运动及感觉的恢复[16-17]。本实验中iPSCs-NSCs 能在支架孔中黏附、存活以及生长，表明生物支架为iPSCs-NSCs 提供了较好的微环境，促进了神经纤维的再生，因此支架和iPSCs-NSCs 具有较好的相容性，与上述研究结果基本一致。

综上所述，UC 来源iPSCs-NSCs 联合3D 打印支架能促进大鼠运动及感觉功能恢复，但目前仅处于基础实验阶段，应用于临床还需更多、更大的样本参与。UC来源iPSCs-NSCs 和3D 打印支架的联合应用为临床治疗ACSI 提供了更为简便的方法，且更容易通过伦理学审查。