N-乙酰半胱氨酸对感染性休克小鼠肺损伤保护作用的研究

黄晓军 陈茜圆 任卓超 金兴

感染性休克患者平均死亡率高达42.9%，是重症患者的首要致死原因[1-2]。感染性休克过程中，诱发大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎性介质释放，导致全身炎症反应综合征的发生，出现多器官功能不全甚至多系统器官功能衰竭[3]。感染性休克会导致严重的肺损伤，发生急性呼吸衰竭。大量研究显示，氧化应激在感染性休克发生、发展过程中起到重要作用[4-6]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）前体，具有很强的抗氧化、抗自由基作用[7-8]。本研究拟评价NAC 能否通过抗氧化应激、抗炎作用，起到减轻感染性休克小鼠肺损伤的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6～8 周雄性SPF 级C57BL/6 小鼠30只，由江苏集萃药康生物公司提供。在屏障环境下饲养，室温20～25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗交替，均自由摄食摄水。操作均严格遵守《实验动物管理条例》的相关规定。

1.2 实验试剂 脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（L2880）、NAC（A7250）均购自美国Sigma 公司；丙二醛（malondialdehyde,MDA）试剂盒（A003-1-2）购自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）试剂盒（KGT001100-2）、TNF-α 试剂盒（KGEMC102a-1）及IL-6 试剂盒（KGEMC004-1）均购自南京凯基生物科技公司。

1.3 动物分组及模型制作 采用随机数字表法将小鼠分为对照组、模型组和NAC 干预组3 组，每组10 只。模型组和NAC 干预组腹腔注射LPS（25 mg/kg，溶于0.2 ml 0.9%氯化钠注射液）制备内毒素诱发感染性休克模型[9]，对照组则腹腔内注射等量0.9%氯化钠注射液。NAC 干预组注射LPS 后即刻腹腔注射NAC（300 mg/kg，溶于0.2 ml 0.9%氯化钠注射液）[10]，而对照组和模型组腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。6 h 后处死小鼠，并立即取出肺组织。

1.4 肺组织形态学变化观察 取部分右肺组织，10%甲醛固定后，经梯度乙醇脱水，二甲苯处理后，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察肺组织形态学变化。根据肺泡腔及间隔炎症细胞渗出情况（0～3 分）、肺泡间隔增宽情况（0～3 分）、肺泡腔出血情况（0～3 分）、肺泡纤维蛋白渗出情况（0～3 分）进行评分，4 项总分为肺组织病理损伤评分[11-12]。

1.5 肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量、SOD 活性测定 取左肺组织制备10%组织匀浆，按照试剂盒说明书，采用ELISA 法测定肺组织中炎症介质IL-6、TNF-α 水平，采用比色法测定肺组织中氧化应激产物MDA 含量和抗氧化酶SOD 活性。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以表示，方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐时，多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两两比较采用Mann-Whitney U 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织形态学变化 光镜下，对照组肺组织结构清晰，肺泡间隔无增宽，可见少量炎性细胞浸润；模型组肺组织损伤明显，肺泡间隔增宽，肺间质及肺泡腔可见大量炎性细胞；NAC 干预组相对模型组肺损伤程度减轻，见图1。对照组、模型组和NAC 干预组肺组织病理损伤评分分别为（1.07±0.30）、（7.31±1.10）和（5.57±0.88）分，3 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组和NAC 干预组肺组织病理损伤评分均升高（均P＜0.05）；与模型组比较，NAC 干预组肺组织病理损伤评分降低（P＜0.05）。

2.2 3 组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比较 与对照组比较，模型组和NAC 干预组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均升高，SOD 活性降低（均P＜0.05）；与模型组比较，NAC 干预组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低，SOD 活性升高（均P＜0.05），见表1。

3 讨论

本研究以腹腔注射LPS 制备内毒素诱发感染性休克模型，该模型已很成熟，笔者也在前期的研究中反复证实了该模型的可靠性。本研究通过NAC 干预感染性休克小鼠模型，结果表明，NAC 可减轻LPS 诱导的感染性休克小鼠肺损伤的严重程度，可使肺组织中SOD 活性升高，IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低。SOD 是一种抗氧化酶，它可以清除氧化应激过程中产生的过多ROS，对机体起到非常重要的保护作用。MDA 是氧化应激过程中产生的高细胞毒性物质，MDA 对机体的危害极大，它与蛋白质、酶发生交联反应而影响其功能。说明NAC 可以通过其抗氧化和抗炎作用，起到保护感染性休克小鼠肺损伤的作用。

图1 3 组小鼠肺组织病理切片所见[a：对照组；b：模型组；c：N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预组；HE 染色，×200]

表1 3 组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比较

NAC 作为祛痰剂应用于临床多年。近年研究表明，NAC 具有很强的抗氧化、去除自由基作用。NAC 的抗氧化应激作用在国内外许多研究中均得到了证实。Hegab 等[13]在“NAC 和金雀异黄素对吲哚美辛诱导的胃损伤模型的保护作用”的研究中发现，NAC 预处理可明显改善溃疡指数，增加NO 水平和SOD 活性，同时明显降低MDA、TNF-α 水平和髓过氧化物酶（MPO）活性。Maheswari 等[14]在“评估NAC 对卡马西平引起的肝毒性的肝保护作用”研究中观察到，NAC 可使GSH 升高，脂质过氧化反应水平降低，并逆转卡马西平诱导的组织病理学异常。Hu 等[15]研究表明，NAC 可降低非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠骨髓中的ROS 水平。

感染性休克是重症患者死亡的首要原因，虽然现今的医疗手段已有很大的提高，但其死亡率仍居高不下。研究表明，感染性休克中机体产生的过多ROS 在全身炎症反应综合征、多器官功能不全的发生和发展过程中起重要作用，因此认为感染性休克是一种高氧化应激疾病[3]。肺是机体通气和氧气交换器官，肺组织氧含量高，因此肺脏也是最容易受到ROS 损害的脏器。感染性休克会导致严重的肺损伤，发生急性呼吸衰竭。转录因子NF-E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor2，Nrf2）在机体抗氧化应激中起到重要的保护作用。正常生理情况下，Nrf2 同胞质蛋白伴侣分子Keap1 偶联，Nrf2 的生物活性受到抑制；当机体产生大量ROS，处于氧化应激状态时，Nrf2 会从Keap1 解离出来并进入细胞核，激发细胞内抗氧化反应元件调控的相关抗氧化和抗炎基因的表达，从而起到对机体的保护[16-17]。NAC 对感染性休克小鼠的肺损伤保护作用可能与其激活Nrf2 有关[18-19]，NAC 通过上调Nrf2，激活相关抗氧化基因的表达，使肺组织中抗氧化指标升高，氧化应激损伤指标和炎症介质水平降低，从而起到减轻感染性休克小鼠肺损伤的作用。

综上所述，NAC 可通过抗氧化应激及清除氧自由基相关物质，从而对内毒素诱发感染性休克小鼠肺损伤起到保护性作用。但感染性休克是一种全身性疾病，可以导致肺、肝、肾、心脏等多脏器功能异常。NAC 能否对其他脏器产生保护作用、改善感染性休克总体预后有待进一步研究；如何优化NAC 的用药方式有待进一步研究和探讨。