ZnT8在胰腺癌发生和发展中的作用

赵俊丽，王 超，李晨阳，周左尧，宋天玲，张红琳

(南京晓庄学院 食品科学学院, 江苏 南京 211117)

0 引言

胰腺癌(Pancreatic Adenocarcinoma)属于消化腺恶性肿瘤，是恶性率最高的肿瘤之一，早期发病不易诊断，高转移性，病程发展非常快，患者愈后极差，治愈率低，患者五年生存率低于8%[1].关于胰腺癌的具体发病机制目前尚无定论.通过对过往的流行病学研究进行回顾发现，糖尿病与胰腺炎等慢性疾病是胰腺癌的诱发因素之一[2].锌离子在包括人类在内的生物体的生存中起着相当重要的作用，它在生命体中含量保持稳态[3].人体内锌稳态受3个蛋白家族的紧密调控，包括溶质载体家族30A(The solute carrier family 30A，SLC30A)编码的锌转运蛋白(Zinc transporters，ZnT)和SLC39A编码的锌转运蛋白ZIP，以及金属硫蛋白[4].由位于人的8号染色体q24.11的SLC30A8基因所编码的ZnT8，包含369个氨基酸，主要局限于胰岛B细胞分泌,负责将锌转运到这些含胰岛素颗粒中，以促进胰岛素成熟和储存[5，6].ZnT8缺失(小鼠模型)或ZnT8等位基因改变(人类R325)减少了分泌颗粒中锌的积累，从而影响胰岛素的加工和结晶，导致葡萄糖诱导的胰岛素分泌减少，然后出现高血糖和糖尿病[7]. ZnT8也是导致儿童和年轻人Ⅰ型糖尿病(T1D)的胰腺B细胞自身免疫的主要自身抗原[8].糖尿病的发病与ZnT8的改变密切相关[9]，然而ZnT8/SLC30A8在胰腺癌的发生和发展中的作用机制仍不清楚.

癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)是综合性多组学肿瘤基因组数据库，它涵盖了 DNA 测序、RNA 测序、拷贝数、甲基化、蛋白谱等多个组学的数据，数据种类多，覆盖面广.cBioPortal是一个基于TCGA数据库的开放免费的流程化分析平台.用户可利用它进行肿瘤数据挖掘，功能齐全，简洁易用.

实验利用TCGA数据库，通过生物信息学分析SLC30A8基因在胰腺癌患者人群中的遗传改变情况、拷贝数变化、共表达基因，生存预后情况、以及GO功能富集分析按条目或功能分类，以及构建共表达基因蛋白质互作图，得到密切相关基因.本研究旨在为探索ZnT8在胰腺癌的疾病发生和发展机制作用方面做基础工作，探寻其作为胰腺癌预防诊断指标和治疗靶点.

1 实验材料与方法

本研究选取了TCGA数据库的胰腺癌泛癌图谱(Pancreatic Adenocarinoma，PanCancer Atlas)中的184个胰腺癌患者临床样本挖掘数据，通过cBioportal(https://www.cbioportal.org/)分析SLC30A8基因相关数据，研究SLC30A8基因在胰腺癌患者中的拷贝数变异和突变情况.通过OncoPrint(基因突变图谱)分析SLC30A8基因在发病人群中的突变情况，制作突变元件图；接着用Co-expression分析与之相关的共表达基因，找出显著相关基因；然后通过Survival比较患者SLC30A8基因是否改变群体的预后生存情况.利用DAVID平台通过功能富集分析得到共表达基因的GO功能分类条目，以此来寻找这些基因可能和哪些功能有关.最后我们通过STRING(https://string-db.org)数据库分析蛋白质相互作用，生成蛋白质互作图，将与之共表达的蛋白之间的联系可视化.使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)平台对共表达基因进行功能富集分析.

2 实验结果与分析

2.1 SLC30A8基因的遗传改变图谱分析

图1显示cBioPortal平台的SLC30A8基因突变图谱图，结果显示在184个总样本中有14人的SLC30A8出现拷贝数扩增，2人发生了SLC30A8的错义突变，该基因发生遗传改变的样本在总体中占9%.那么SLC30A8遗传改变与胰腺癌的发生和发展存在着什么联系，我们需要接下来的数据分析来探究这种联系.

2.2 基因突变图

由cBioPortal平台的Mutation界面分析的SLC30A8在胰腺癌患者中的突变图(见图2).SLC30A8的功能域结构图上标记了发生特异突变的位置，表1中显示样本标记突变类型，蛋白质改变，拷贝数变化.结果发现在SLC30A8基因上有两个突变位点，类型为错义突变.

图2 SLC30A8突变图

表1 突变样本信息表

2.3 预后生存分析

由cBioPortal平台的Comparison/Survival界面分析得到该胰腺癌患者群体的生存曲线图.临床以及生命科学领域最常用生存率曲线(也称Kaplan-Meier曲线)来描述各组样本的存活情况(图3).结果显示，总体生存期(图3A)、无进展存活期(图3B)、疾病特异性生存期(图3D)的SLC30A8基因改变组与未改变组相比，存活时间下降，且p值均小于0.05，有显著性差异.说明SLC30A8的基因改变对患者的预后生存期有影响作用.

图3 生存分析

2.4 共表达基因分析

由cBioPortal平台的Co-Expression页面分析的与检索基因共表达相关的的基因的基本信息，包括染色体区段、Spearman相关系数、p值和q值(用来判断假设检验).根据基因的表达值计算目的基因与其它基因的相关系数，由相关系数的绝对值的大小，表示两者相关性的强弱(正数代表正相关，负数代表负相关).根据Spearman相关系数数值，选取与SLC30A8基因表达呈强正相关的前25个基因，同时满足p<0.05(见表2).

表2 与SLC30A8表达正相关的基因(top25)

2.5 功能富集分析

本实验利用DAVID网站在线分析了与SLC30A8基因相关的共表达基因的GO功能富集分析(基于GO数据库).共表达正相关基因功能的生物过程(Biological Process，BP)富集分析结果如表3所示.结果表明，正相关基因BP参与了激素介质凋亡信号通路、胰岛素分泌、葡萄糖代谢正调控、葡萄糖代谢调控等过程；正相关基因参与的多为胰岛细胞的生命过程以及相关代谢.

表3 SLC30A8共表达正相关基因的功能富集分析结果(BP)

2.6 蛋白质互作网络分析

根据GO功能富集分析得出的结果，我们选取与SLC30A8基因正相关的top25共表达基因,利用STRING开始蛋白质互作分析.其结果列于图4，其中图中隐去了无关联结点蛋白.每一个结点代表一种蛋白质，节点之间的关系用线表示，线越粗则表明两者相互作用越强，结点中的一种颜色代表BP中的一种功能.INS、PCSK2、G6PC2、GCK、ABCC8、IAPP等基因与之共表达，且它们与SLC30A8的关系更为紧密.这些蛋白质很可能是胰腺癌发病的重要致病因素，有望成为潜在的治疗靶点.

图4 SLC30A8共表达基因网络图

3 结论

肿瘤的生长离不开锌，正常细胞内的锌离子浓度保持稳态，胰腺癌的发生与转移与其稳态失控相关[10].通过对TCGA数据库中胰腺癌患者的临床数据的分析研究，我们发现编码ZNT8的SLC30A8基因在样本中发生了扩增和错义突变的基因改变；在总体生存期，无进展生存期和疾病特异性生存期中SLC30A8遗传改变组的生存率都显著低于未改变组，显示改变组预后较差.GO功能富集分析显示，与SLC30A8共表达基因成正相的参与胰岛素表达调控，葡萄糖合成、代谢等过程.在胰腺癌的发展过程中，SLC30A8与其正相关的共表达基因共同参与作用，由蛋白质互作网络图发现INS、PCSK2、G6PC2、GCK、ABCC8、IAPP调控的蛋白与SLC30A8共表达关系更为紧密，我们还需对这些共表达基因在多个数据库和多种胰腺癌临床资料中作进一步的综合比较分析.由于肿瘤是通过多基因的改变而发生的，基因扩增是促进肿瘤发生的有效加速机制[11]，肿瘤相关基因的识别可以提供新的有效的治疗靶点.因此我们推测SLC30A8基因可能是胰腺癌发生和发展中的重要因素之一，但其在胰腺癌发病中的具体机制还需进一步的深入研究.