痰诱导技术应用于肺结核病原学诊断的研究进展

韩梅 韩璞 陈雅婷 杨松 严晓峰

可用于调查气道炎症的方法包括直接方法(如支气管活检或支气管肺泡灌洗)和间接方法(如症状评估、血样分析和肺功能测试)。直接方法的优点是能够可靠地评估气道炎症，但由于这种技术具有侵袭性，会引起患者的不适，增加风险，不适合大规模使用。而间接方法与气道炎症的直接评估相关性较差[1]。痰液采集是一种从气道收集细胞的方法，可以直接评估气道炎症。然而，自咳痰(self-expectoration，ES)可能导致样本质量差，且对患者可能有选择性。

痰诱导(sputum induction，SI)处理技术是以高渗或等渗盐水雾化吸入诱导无痰或少痰患者产生足量痰液，以便对气道分泌物中的细胞及其他液相成分进行分析研究的一种无创的采样方法。关于SI的机制尚未完全被知晓，但普遍认为气道内液体渗透性的增加导致支气管黏膜血管的通透性增加，进而诱导黏膜下腺黏液的产生。目前，SI已被广泛用于优化各种呼吸道疾病的检测，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、慢性咳嗽、肺结核和肺癌[2]。在哮喘和COPD的管理中，其他有创检测手段还有可能增加对痰嗜酸性粒细胞识别的局限性[3]。而SI作为气道炎症的无创检测，其临床应用凸显了巨大的潜力。

一、SI技术的研究进展

SI是一种相对安全、无创的获取囊性纤维化患者气道分泌物的方法，特别是对那些正常情况下不易产生痰的患者。目前SI没有标准方法，可在固定时间内依次吸入浓度逐渐增加的高渗性氯化钠溶液，或吸入固定浓度的高渗性氯化钠溶液，逐渐延长吸入时间直到收集到足够多的痰量。国内基本均采用吸入3%盐水的固定时间间隔法。20世纪80年代以来，鉴于艾滋病的血液传播途径和SI的非损伤性，通过吸入高渗盐水(hypertonic saline，HS)进行诱导已成功用于HIV感染者并发卡氏肺孢子虫肺炎的诊断[4]。1992年，Pin等[5]首次将SI方法进行改良后用于哮喘患者痰液的细胞计数。近年来，SI及其后续处理被改进为一种用于下呼吸道炎症诊断的无创采样技术，对诱导痰进行细胞分型和计数，被用于多种呼吸系统疾病的诊断、研究和治疗[2, 6]。比如通过SI获取的痰进行炎症指数的检测有助于了解哮喘患者炎症细胞、介质和细胞因子之间的相互作用机制；在COPD患者中，痰液评估可作为决定是否进行长期皮质类固醇治疗前的筛查试验；对于不能产生痰的结核病患者或者结核病并发HIV感染者，SI也是有价值的痰液采集方法。此外，SI也可用于肺癌诊断标本的采集。目前，还没有其他非侵入性气道炎症采样方法证明对减少肿瘤恶化更有效[6]。

笔者通过PubMed数据库进行文献检索，从1990—2020年，共收录1049篇与SI相关的论文，其中临床研究155篇，随机对照研究100篇，荟萃分析4篇，综述98篇，系统综述 6篇。SI的效果在实际临床中很少被评估。因此，迫切需要将SI实验室研究转化为临床应用研究。

痰液处理的主要目的是获得差异细胞计数，以研究存在于气道腔内的细胞类型。对痰上清液和痰细胞进行进一步的分析，可以深入研究炎症过程和免疫机制。例如，研究痰上清中的介质，采用其他技术对痰细胞进行深入分析，如流式细胞术、基因组学或蛋白质组学[1]。

HS诱导是目前最广泛用于SI的方法。一般采用超声雾化仪给患者吸入高渗(5%)或等渗盐水10～20 min进行诱导[1, 4]；目前文献中常用的两种痰液处理方法包括全痰法(whole sputum technique)和选择痰塞法(the plug selection)[7]。一般使用二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)对痰中的黏膜进行熔解和匀浆[1, 8]。而Pin等[5]建议对患者采取吸入沙丁胺醇后，再吸入3%～5%高渗生理盐水30 min的方法进行SI。近年来，SI技术除了传统的HS诱导之外，也出现一些新技术。一项关于肺笛(lung flute，LF)与传统的吸痰方法、高渗盐水痰诱导方法(hypertonic saline induction，HSI)效能的比较研究显示，无诱导的传统吸痰、LF与HSI采集的痰液结核分枝杆菌核酸扩增检测结果分别为60.0%、72.0%和60.0%，差异无统计学意义(P=0.341)。LF与HSI所获得的痰标本具有相似的扩增效率，且并发症相对较少；与HSI相比，LF诱导显示总不良事件明显减少(15.8%vs. 34.9%，P=0.023)[9]。

另一项旨在比较HS技术、物理痰液收集技术(physiotherapy，P)和HS+P技术在儿童和青少年哮喘患者中进行SI有效性的随机对照研究结果显示，采用3种方法获得痰样本总细胞数和炎性细胞数的差异无统计学意义。HS+P技术获得的痰液质量明显高于HS和P技术。3种技术获得的细胞百分比均大于50%，P和HS差异无统计学意义。此外，诱导痰液操作对患者肺功能无任何影响[10]。此外，对于哮喘控制良好的儿童和青少年，P技术的操作是安全和有效的。

一项关于HS浓度与疗效的荟萃分析显示，通过比较3% HS和0.9%生理盐水，分析3%HS治疗毛细支气管炎的疗效。结果显示，3%的HS结合肾上腺素可明显减少患者住院时间，且对降低再入院率有效(RR=0.93，95%CI=0.70～1.23)[11]。

既往研究未报导过HS相关的严重不良反应。Carlsten 等[12]对采用HS进行SI的安全性评估结果显示，常见的不良反应有轻度鼻出血(8例，16.6%)、恶心(3例，6.25%)、咳嗽增加(3例，6.25%)；只有1例婴儿在2次手术中出现过短暂的低氧血症(最低氧饱和度为87%)。在SI技术应用于早期呼吸药物发展作用的研究中，对于SI技术稳定性的研究结果，痰量充足和不充足样本组之间差异无统计学意义，但在健康受试者中仅具有一定的可重复性[13]。

二、SI技术在肺结核病原学诊断中的意义

1. SI与侵袭性技术采集标本对结核病患者检出率的比较：SI已被证明可以提供与更有侵袭性的技术(如支气管镜)类似的结核病患者检出率，它在儿童结核病的诊断取样和对结核分枝杆菌潜伏感染的筛查中显示了更好的作用[13]。用于肺结核诊断的标本类型包括痰、支气管灌洗液、气管分泌物、胸腔积液、脑脊液等，痰是最易获得的标本类型。SI标准化方法的建立和发展提高了痰标本的质量和结果的可重复性，而高质量的痰有助于提高肺结核病原学诊断的敏感度，从而提高肺结核的诊断效率。

一项比较痰涂片阴性肺结核患者的诱导痰和支气管灌洗液的研究显示，在120例痰涂片阴性肺结核患者中，诱导痰涂片检出抗酸杆菌76例(63.3%)，支气管灌洗液检出抗酸杆菌94例(78.3%)。空洞性和浸润性病变肺结核患者的痰标本涂片阳性率比肺实变和肺门下病变的痰标本涂片阳性率高[14]。虽然诱导痰和支气管灌洗液对痰涂片阴性的活动性肺结核(active pulmonary tuberculosis，APTB)的诊断均有价值，但HS应作为首选，而且HS诱导可在1 d或连续2 d内重复2～3次。如果患者诱导痰涂片仍为阴性且临床患肺结核可能性高，便可以开始进行抗结核治疗，同时需密切监测患者，对抗结核治疗后病情未好转的患者，需再进行支气管镜检查并排除其他诊断。

2. SI与ES对结核病患者检出率的比较：我国肺结核的细菌学确诊阳性率远低于世界平均水平[15]。一项多中心随机对照试验从中国3个县招募了980例成人疑似结核病患者，比较在涂片、培养或分子检测(EasyNAT或GeneXpert MTB/FIF)中检测到阳性患者的比例。50%的参与者(490例)被随机分配到干预组，接受研究护士的指导，并在必要时进行SI；其余490例患者未接受SI。结果显示，接受SI组细菌学阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义，总体阳性诊断率分别为32%(159/490)和25%(122/490)(P=0.009)。大部分改善发生在单独接受指导的患者中，而年轻患者改善最大(OR=1.27，95%CI=1.05～1.53)。研究认为，采用简单的分步操作结合SI，可明显提高细菌学确诊结核病的比例[15]。

用HS雾化法采集的痰标本显示，其诊断敏感度高于ES，主要体现在提高对痰涂片阴性或痰量不足患者的诊断敏感度上。一项前瞻性随机病例对照研究显示，高度怀疑APTB的受试者通过ES或在临床用7%盐水雾化诱导，连续3 d提供3组(采用ES和SI分别获得的2份标本称为一组)痰标本。标本采用镜检、培养和核酸检测比较诊断结果。76例患者被分配到两个组(ES 38例，SI 38例)；共51例(27例 ES和24例SI)患者被确诊为APTB。在APTB患者中，SI组(63.1%)采集到标本的比例明显高于ES组(42.5%)，差异有统计学意义(P=0.010)。在细菌学诊断阳性率方面，SI组(58.3%)和ES组(48.1%)差异无统计学意义(P=0.460)。当日痰液镜检及PCR病原学诊断结果显示，SI组9例(37.5%)阳性，ES组7例(25.9%)阳性，差异无统计学意义(P=0.370)。该研究认为，SI能提高肺结核病原学诊断过程中痰标本的充足性[16]。

另一项研究采用ES和SI两种方法收集了164例临床和放射学怀疑为肺结核患者的痰标本，在咳痰患者中，所有患者均用3%无菌HS雾化吸痰15～20 min。164例患者中，132例(80.5%)患者第1天(自发)和第2天(诱导)均可获得痰标本。第1天(自发)痰标本显示，抗酸杆菌(acid-fast bacilli，AFB)涂片阳性20例(15.15%)，AFB培养阳性24例(18.18%)；第2天(诱导)痰标本显示，AFB涂片阳性28例(21.21%)，AFB培养阳性36例(27.27%)。该研究认为，在咳痰患者中，自发和诱导的痰标本对抗酸杆菌涂片和培养阳性检出率结果相近，SI可提高无痰患者的AFB诊断阳性率[17]。

通过SI可以辅助诊断结核病，但是来自HIV流行地区的成人数据有限，而且还不清楚如何区别应用于不同临床背景(住院患者与门诊患者)、不同艾滋病进展程度，以及患者是否为涂片阴性或痰少者。在南非开普敦，一项对696例疑似涂片阴性或痰少型成人结核病患者进行的研究显示，SI由护理人员在封闭式负压诱导室中进行，约20 ml 5%的无菌HS通过Wilson’s 402A超声雾化仪输送15～20 min，直到收集到2～4 ml的诱导痰液。82%(573/696)的患者提供了≥1 ml的痰样本，随机抽取278份标本进行验证，标本足量比例为83%(231/278)。经诱导获得痰标本培养后15%(96/652)呈阳性。SI对疑似肺结核培养阳性诊断率的影响在HIV感染者(10%，25/244)和HIV阴性者(17%，51/244)之间，差异有统计学意义(P=0.010)。在HIV流行地区，尽管结核病培养阳性率在住院的HIV感染者中大约高出2倍，但有1/5的患者经过诱导后仍然无法提供足够的痰标本[18]。

一项在南非的研究评价了SI技术在大规模结核病控制项目中的应用。SI在对结核分枝杆菌潜伏感染筛查中也有重要作用。在南非一个开展HIV抗逆转录病毒治疗的诊所，602例HIV成年感染者接受了基于培养的结核分枝杆菌潜伏感染筛查[19]。对于那些不能自行咳痰的患者(124例)，使用雾化HS诱导痰获得第一份样本，10～15 min后快速获得第二份样本。结核分枝杆菌培养阳性率为15.6%(95%CI=12.8%～18.8%)。在所有培养阳性的痰标本中，自发咳痰标本占79.8%，经过诱导，第一份痰标本阳性诊断率提高了5.3%，第二份痰标本提高了14.9%。

肺结核诊断从常规痰培养改为诱导痰培养可以缩短住院天数，减轻患者负担而不增加额外风险。在APTB患者中，常规咳痰比诱导痰可增加住院天数和患者费用支出。一项关于诱导痰技术的前瞻性研究估算了诱导痰的直接费用。结果显示，在少痰或无痰的1648例疑似肺结核患者中，558例患者的诱导痰涂片呈阳性，其中353例既往痰涂片呈阴性，97例痰量不足，108例无痰。每次诱导痰的直接费用为0.37美元。该研究认为，在结核病控制规划中，SI是提高痰检阳性率的一种有效、低成本、简便的方法[20]。一项在2家医院开展的6个月的回顾性和前瞻性研究结果显示[21]，通过诱导痰，隔离时间可从7 d减少至4 d，每例患者节省了7275美元，没有增加额外的风险。

此外，肺结核诊断中，洗胃(gastric lavage，GLA)是一直被推荐的用于儿童的采样方法，尽管其具有低侵入性，但通常要求入院和隔夜空腹。因此，近年来，在很多发展中国家和HIV高流行地区，SI被广泛用于儿童结核病的诊断。与GLA相比，SI更加无创，耗时更少，而且可以在门诊完成。一项在马德里21家医院儿科进行的多中心前瞻性研究表明，采用5 ml 5%的无菌盐溶液，流速为5 L/min，雾化15 min 诱导后，使用无菌黏液吸引器经鼻咽吸痰。研究结果显示，在结核病的实验室微生物学诊断阳性率方面，SI与GLA相比差异无统计学意义[22]。

3. SI技术用于肺结核分子诊断的效能：关于SI样本对分子生物学检测技术诊断肺结核的效能，已经有了一些研究。在南非开普敦的一家儿童医院进行的关于GeneXpert MTB/RIF检测敏感度的研究结果显示，SI和GLA诊断效能差异无统计学意义，不足以证明在疑似肺结核幼儿中选择SI采样方法优于GLA采样方法[23]。另一项在印度新德里进行的双盲随机对照试验显示，在403例4个月至14岁的儿童中，将SI和GLA应用于肺结核的GeneXpert MTB/RIF检测中，样本存储时间可影响其测试性能(P=0.0001)，在保存650～849 d的涂片阳性标本中，SI和GLA标本的敏感度分别为85.7%和77.1%，但如果保存1050 d以上，敏感度分别下降至33.3%和50%，差异有统计学意义[24]，提示SI可提高GeneXpert MTB/RIF检测肺结核的阳性率。Paiva等[25]将116份经5% HS诱导的痰标本分别用于PCR、培养、镜检的前瞻性比较研究。结果显示，经诱导后的痰标本镜检阳性率为7.8%(9/116)，培养阳性率为18.1%(21/116)，PCR阳性率为59.5%(69/116)。PCR检测的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为95.2%、48.4%、29.0%和97.9%。研究认为，与培养相比，尽管PCR方法的特异度被低估，但如此高的敏感度更有可能是假阳性引起的(该研究使用的PCR检测商品化试剂Detect-TB产自巴西Labtest公司)。

此外，还有一些研究由于使用的方法和试剂差异，以及样本量较小的原因，研究结论尚不统一[26-28]。关于SI技术应用于肺结核的分子诊断效能还需要更多设计缜密的研究来支撑。

4. 使用SI技术的限制因素：也有一些研究结果认为SI和常规痰液收集方法相比并未提高肺结核的诊断效率。一项在南非开展的研究，采用SI和常规方法对清晨痰液样本和“斑点”痰样本进行肺结核诊断效率的差异比较。对门诊疑似结核病患者通过HS(5%)雾化诱导分别采集清晨痰液样本和“斑点”痰液样本。比较清晨痰液样本和“斑点”痰液样本涂片镜检和液体培养阳性率，以及培养阳性的时间。共有555名受试者完成了SI程序，其中129份样本(23%)为结核分枝杆菌培养阳性，清晨痰液的分枝杆菌生长指示管(MGIT)培养阳性时间较“斑点”痰液短。采用SI和常规方法对清晨痰和“斑点”痰进行培养，阳性率差异无统计学意义(P=0.820)。该研究认为，SI可以缩短结核分枝杆菌培养阳性的时间，但与常规痰液收集相比，不增加培养阳性率。因此，不推荐在高负担社区对疑似结核病的门诊患者在初诊时采用SI作为常规收集方法[29]。

一项关于确诊阳性率的Meta分析结果不推荐使用特定的雾化盐浓度用于SI。该研究筛选了90篇论文，分析了17篇论文。采用卡方检验、I2和Meta回归分析评估异质性，综述了来自SI的结核分枝杆菌培养的研究报道。在975例经培养确诊的结核病患者中，共报告了627例SI培养阳性患者。SI的阳性诊断率在35%～95%之间。合并诊断效率为74%(95%CI=65%～81%)，有明显的异质性(P<0.0001，I2=86%)[30]。HIV流行率或年龄对SI对结核分枝杆菌培养阳性率差异无统计学意义。单因素分析结果表明，使用纤维支气管镜(FOB)作为对照，SI的确诊阳性率降低了22%(95%CI=2%～42%)。然而，调整混杂后，Meta回归分析结果显示，FOB使用量(P=0.210)和HS浓度(P=0.310)与确诊阳性率并不是独立相关的。在研究规定的条件下，SI能检测出约3/4的结核病患者。HIV流行程度、年龄或使用FOB作为对照，无法解释阳性诊断率的明显异质性。基于此Meta分析，不能推荐使用特定的雾化盐浓度用于SI。SI获取的样本质与量还与雾化方法、雾化气体流速、雾化颗粒大小和雾化持续时间等有关[31]。

三、总结

本文综述了SI技术的发展现状和临床应用情况，分别阐述了不同的SI方法，包括HS、LF、P、HS+P在临床应用中的差异，同时也综述了通过常用的HS来诱导痰在结核病病原学诊断中的临床价值。总的来说，SI的优势体现在无创、低风险，可广泛应用于气道炎症的无创检测(哮喘、COPD、慢性咳嗽或特发性肺纤维化、结核病)。大部分研究认为其结果稳定可重复，提高了病原微生物的检出率；广泛适用于各种人群，也适用于对儿童呼吸道疾病的诊断取样。此外，采用SI技术有助于缩短结核分枝杆菌培养的时间，可减轻医疗支出和患者负担。但即便如此，与常规痰液收集相比，不增加培养阳性的比例，因此不能推荐在高负担社区疑似结核病的门诊患者初诊时采用SI作为常规收集方法。此外，SI技术的安全性，比如在运动性支气管收缩中的应用，尚未得到完全证实，还需要更多临床试验的支持。为提高无痰或少痰肺结核患者的确诊阳性率，可采用SI和BALF进行联合检测，SI适宜获取大气道分泌物，而BALF适宜获取小气道和肺泡灌洗液，二者具有互补性，但联合检测是否可提高疗效和确保安全性有待进一步采取随机对照前瞻性研究加以证实。