结核性胸膜炎的生物标志物诊断研究进展

桂徐蔚 柯荟 顾瑾

2017年全球新发结核病患者630万例，16%为肺外结核，其中结核性胸膜炎为成人肺外结核最常见的类型[1]。美国结核性胸膜炎占所有结核病患者的3.7%[2]，巴西占8.7%[3]，中国占6.5%～8.7%[4-5]，西班牙占10%～19.3%[6-8]，非洲国家可超过20%[9-10]。印度30%～80%的胸腔积液为结核性胸膜炎[11]。在结核病流行率高的国家，结核性胸膜炎是胸腔积液的主要原因。

目前结核性胸膜炎的诊断金标准仍然是菌种鉴定为结核分枝杆菌，但胸腔积液中难以检测出结核分枝杆菌，有时甚至需要手术获取胸膜组织进行组织学、微生物学或分子检查，因此临床需要结合细菌学、病理学、分子生物学、细胞免疫学及综合性诊断策略来实现，且与恶性胸膜疾病及其他感染性胸膜疾病鉴别诊断困难。近年来，针对结核性胸腔积液生物标志物的研究众多，核酸检测技术的进步及在结核病领域的广泛应用也为结核性胸膜炎提供了新的诊断方法。虽然目前尚无单一有效的确诊生物标志物，但多种方法的联合应用可极大提高诊断的准确性[12]。

一、免疫学诊断方法

众所周知，胸膜腔内的结核分枝杆菌可激活CD4+T淋巴细胞，并触发延迟超敏反应。免疫反应由γ干扰素(IFN-γ)等介导，反馈机制涉及其他细胞因子如白细胞介素(IL)等。在结核病中、高发病率地区，腺苷脱氨酶(ADA)、IFN-γ和IL-27有助于临床表现符合疑似结核性胸腔积液患者的诊断。

1. ADA：ADA是一种参与嘌呤代谢的酶，存在于多种类型的细胞中，尤其是活化的T细胞，在T淋巴细胞的分化中发挥重要作用。自1978年Piras首次报道结核性胸膜炎患者的胸腔积液ADA升高以来[13]，与其相关的研究一直是热点所在。

胸腔积液ADA诊断结核性胸膜炎的敏感度和特异度分别为88%～100%和81%～97%，在HIV感染者中亦有相似的诊断率[14-15]。目前已知存在ADA1和ADA2两种同工酶，ADA1在淋巴细胞和单核细胞中活性较高，ADA2则主要在单核细胞和巨噬细胞中。在结核性胸膜炎中，ADA2同工酶占总ADA活性的88%。因此，ADA1/总ADA<0.42的准确性优于总ADA，其敏感度为100%，特异度为97%～99%[16]。一项纳入387例结核性胸膜炎患者的研究结果显示，与总ADA(临界值：52.4 U/L)相比，ADA2(临界值：40.6 U/L)的诊断性能更优，敏感度和特异度分别为97.2%和94.2%，而总ADA的诊断敏感度和特异度分别为93.7%和88.7%[17]。研究显示，总ADA值低于40 U/L时，诊断结核性胸膜炎有极好的阴性预测值(negative predictive value，NPV)，当总ADA值高于70 U/L时，诊断结核性胸膜炎有极好的阳性预测值(positive predictive value，PPV)。然而，在结核病低流行地区，PPV可低至15%。当结核病的预测概率在10%、20%、30%时，估计PPV分别为66%、81%、88.5%，NPV为95.6%～98.8%[18]。

其他疾病也可能导致胸腔积液ADA增高，最常见的是并发于肺炎的胸腔积液 (1/3的患者ADA会增高)和脓胸(2/3的患者ADA会增高)；另外淋巴瘤、实体瘤、结缔组织疾病(主要是类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)和布鲁杆菌病、昆士兰蜱传斑疹伤寒、组织胞浆菌病和球孢子菌病亦有ADA增高的报道[19]。胸腔积液ADA增加的患者中，若胸腔积液细胞分类以淋巴细胞为主，主要与非霍奇金淋巴瘤鉴别；若胸腔积液细胞分类以中性粒细胞为主，可评估乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)/ADA的比率，与并发于肺炎的胸腔积液进行鉴别，其LDH/ADA比率较结核性胸膜炎升高10倍以上[20]。

综上所述，ADA是一种用于结核性胸膜炎诊断的高敏感度及特异度的生物标志物，特别是在结核病中高发病率地区。尽管ADA2具有优越的性能，但在临床实践中，仍推荐应用胸腔积液总ADA值，因其敏感度高、成本低，并可在数小时内获得结果，这对我国基层实验室的广泛开展尤为重要。

2. IFN-γ：IFN-γ是一种由CD4+T淋巴细胞激活后释放的细胞因子，能增加巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀菌活性，是一种高效的诊断结核性胸膜炎的生物标志物。

为了评估IFN-γ在胸腔积液诊断中的敏感度、特异度和其他准确性指标，Jiang等[21]纳入了22项研究并进行荟萃分析，结果显示：IFN-γ的敏感度为89% (95%CI：87%～91%)；特异度为97% (95%CI：96%～98%)；阳性似然比为23.45 (95%CI：17.31～31.78)；阴性似然比为0.11 (95%CI：0.07～0.16)；诊断优势比为272.7 (95%CI：147.5～504.2)。Greco等[22]进行了一项荟萃分析，纳入了31个ADA的临床研究(4738例患者)及13个IFN-γ的临床研究(1189例患者)。受试者工作特征曲线显示，ADA和IFN-γ的最大联合敏感度和特异度分别为93%和96%。在结核性胸膜炎患病率为5%、25%和85%的情况下，ADA阴性的验后概率分别为0.4%、2.4%和24%，IFN-γ阴性的验后概率分别为0.22%、1.2%和17%。因此，这两种生物标志物在诊断结核性胸膜炎方面都是非常准确的。

虽然IFN-γ特异度更高，但在恶性肿瘤和脓胸患者中亦可能升高；此外，高成本、量化技术、临界值不确定是限制其在实验室应用的重要因素。

3.γ干扰素释放试验(interferon-γ release assay，IGRA)：IGRA是通过结核分枝杆菌特异抗原刺激T淋巴细胞释放IFN-γ来检测是否为结核分枝杆菌感染的检查方法。阳性表明既往感染过结核分枝杆菌。与PPD相比，IGRA检测阳性可排除卡介苗接种及大部分非结核分枝杆菌感染[23]。

然而，胸腔积液IGRA检测对结核性胸膜炎的诊断效能是有争议的。为了评估血液和胸腔积液IGRA检测对结核性胸腔积液的诊断效能，Aggarwal等[24]进行了荟萃分析，纳入19项研究，血液和胸腔积液检测分别涉及1085例和727例受试者。结果发现：血液IGRA检测的敏感度和特异度分别为77% (95%CI：71%～83%)和71% (95%CI：65%～76%)；胸腔积液IGRA检测的敏感度和特异度分别为72%(95%CI：55%～84%)和78%(95%CI：65%～87%)。由此得出结论：基于血液和胸腔积液的IGRA检测对疑似结核性胸腔积液患者的诊断准确性较差。Pang等[25]对15项研究进行了荟萃分析，评估IGRA对结核性胸腔积液诊断的准确性指标。结果显示：结核性胸腔积液患者中，血液IGRA检测的敏感度和特异度分别为80%(95%CI：76%～83%)和70%(95%CI：65%～75%)；阳性似然比为2.48 (95%CI：1.95～3.17)；阴性似然比为0.30 (95%CI：0.24～0.37)；PPV为0.79 (95%CI：0.60～0.87)；NPV为0.75 (95%CI：0.62～0.83)；诊断优势比为9.96 (95%CI：6.02～16.48)；受试者工作特征曲线下面积(area under curve，AUC)为0.89。胸腔积液IGRA检测的敏感度和特异度分别为82%(95%CI：79%～85%)和87% (95%CI：84%～90%)；阳性似然比为4.94 (95%CI：2.60～9.39)；阴性似然比为0.22 (95%CI：0.13～0.38)；PPV为0.91 (95%CI：0.85～0.96)；NPV为0.79 (95%CI：0.71～0.85)；诊断优势比为28.37 (95%CI：10.53～76.40)；AUC为0.91。可见，胸腔积液IGRA是一种潜在的辅助诊断方法，但高成本和中效能限制了其在实验室的广泛应用。

虽然胸腔积液IGRA较血液的诊断效能更好，但IGRA检测用于结核性胸膜炎的诊断仍有争议。研究结果的异质性可能与结核病流行情况和IGRA诊断结核性胸膜炎的临界值标准不同有关。

4. 其他生物标志物：结核性胸膜炎患者的胸腔积液中有众多生物因子水平增高， IL-27是经证实的诊断效能较高的生物标志物，其他生物因子如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-2可溶性受体(soluble receptor of interleukin-2，sIL-2Rs)、IL-18、免疫抑制酸蛋白(immunosuppressive acid protein，IAP)和白细胞介素-12p40亚基(interleukin-12 p40 subunit，IL-12p40)、溶菌酶水平亦增高，但它们的诊断特异度较低，临床相关性及诊断效能仍需要进一步确定[26]。

IL-27是白细胞介素-12家族的成员，通过T辅助1型反应参与IFN-γ的产生。许多研究，包括一些荟萃分析，均报告了IL-27对结核性胸膜炎诊断的有效性[27-30]。在Liu等[28]的荟萃分析中总结了IL-27在区分结核性胸腔积液与恶性胸腔积液(两者胸腔积液的细胞分类均以淋巴细胞为主)方面的出色表现。共纳入7项病例对照研究，共550例患者(285例结核性胸腔积液患者和265例恶性胸腔积液患者)。IL-27在诊断结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中的综合评价分别为：敏感度93% (95%CI：90%～96%)、特异度97% (95%CI：94%～98%)、阳性似然比25.88 (95%CI：13.84～48.39)、阴性似然比0.07 (95%CI：0.05～0.11)、优势比333.26 (95%CI：146.10～760.19)，AUC为0.99。由此得出结论：IL-27在结核性胸膜炎的诊断中具有较高的敏感度、特异度和准确性。我国Wu等[29]的研究比较了IL-27、IFN-γ和(或)ADA联合用于鉴别结核性胸膜炎和其他病因胸腔积液的诊断准确性，结果发现：这3种生物标志物的联合使用可使诊断的敏感度或特异度提高至100%。由此得出结论，IL-27是诊断结核性胸膜炎最有效的生物标志物，IL-27单独或联合IFN-γ和ADA可能是临床诊断结核性胸膜炎的优选策略。李芳等[30]的研究纳入因胸腔积液就诊的88例患者，其中结核性胸腔积液44例、恶性胸腔积液20例、炎性胸腔积液12例和漏出性胸腔积液12例。检测各类患者胸腔积液中IL-27、IFN-γ和ADA的水平，绘制受试者工作特征曲线，根据敏感度、特异度和准确度等指标评价其对结核性胸膜炎的诊断价值。结果发现：结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-27和IFN-γ水平明显高于其他三组(P<0.05)。胸腔积液中IL-27、IFN-γ和ADA诊断结核性胸膜炎的敏感度分别为100.0%、61.4%和78.6%；特异度分别为94.4%、89.5%和92.1%； AUC分别为0.96、0.79和0.92；IL-27、IFN-γ和ADA三者联合检测时，特异度(97.4%)高于单独检测。由此得出结论：胸腔积液IL-27对结核性胸膜炎诊断价值高于IFN-γ和ADA，三者联合可以提高检测的特异度。

总之，在结核性胸膜炎的诊断中，IL-27是一种潜在的有效生物标志物，与其他生物标志物联合使用时，诊断的敏感度或特异度可进一步提高。

二、分子生物学诊断方法

近年来分子检测技术取得了飞跃的进步，核酸扩增试验(NAATs)和GeneXpert MTB/RIF的优势明显，已广泛应用于结核病及耐多药结核病的准确、快速诊断。结核性胸膜炎的胸腔积液分子检测特异度高，但敏感度有限，诊断性能尚有欠缺。

1. NAATs：诊断结核性胸膜炎的金标准为结核分枝杆菌阳性，但由于结核分枝杆菌生长缓慢，且阳性率低，导致诊断延误。NAATs可用于胸腔积液或胸膜组织等临床标本的结核分枝杆菌基因快速检测。仅需结核分枝杆菌达到102CFU/ml，结果可以在数小时内获得，且不受患者的免疫功能影响[31]。NAATs中使用的靶基因有IS6110、GCRS、MPB-64、devR或CD192等，它们具有不同的敏感度和特异度。研究表明，结核分枝杆菌基因组的DNA序列检测具有更好的诊断性能。

NAATs的敏感度仍取决于胸腔积液结核分枝杆菌的镜检和培养结果。Moon等[32]报道，当胸腔积液结核分枝杆菌镜检阴性及培养阳性时，敏感度为33%；当两者均为阴性，仅胸膜活检为阳性时，敏感度仅为3.7%。NAATs的敏感度低主要是因为胸腔积液中结核分枝杆菌数量较少，也可能与胸腔积液中存在的固有抑制剂及结核分枝杆菌的胞内隔离有关，这些均阻碍了DNA的提取和扩增[31]。

GeneXpert MTB/RIF为目前临床应用较为广泛的核酸扩增检测方法。GeneXpert MTB/RIF是一种快速、自动化的分子检测方法，痰结核分枝杆菌涂片阳性患者的敏感度和特异度较高，均为98%，但痰结核分枝杆菌涂片阴性患者的敏感度和特异度较低，分别为67%和99%[33]。GeneXpert MTB/RIF诊断结核性胸膜炎的结果不尽如人意。

Penz等[34]和Sehgal等[35]的2个荟萃分析研究显示，GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度为37%～51.4%，特异度较高，可达99%。这些荟萃分析将GeneXpert MTB/RIF结果与微生物标准或其他参照标准进行对比，评估了GeneXpert MTB/RIF的性能。结果发现：在结核分枝杆菌培养或PCR阳性的情况下，GeneXpert MTB/RIF可获得最佳的敏感度结果。Meldau等[36]进行了一项前瞻性队列研究，纳入93例胸腔积液患者，包括40例确诊的结核病患者，5例结核可能患者和48例非结核病患者。研究评估了胸腔积液结核分枝杆菌镜检、ADA、IFN-γ和GeneXpert MTB/RIF的诊断效能。结果发现：IFN-γ的敏感度最高，为92.5%，ADA的敏感度中等，为55.3%～79.0%，GeneXpert MTB/RIF的敏感度最低，为22.5%，且样品离心并没有提高GeneXpert MTB/RIF的检测敏感度。3种诊断方法特异度均较高，可达92.0%。由此得出结论：GeneXpert MTB/RIF检测对诊断结核性胸膜炎的价值有限，而IFN-γ是一个很好的诊断和排除结核性胸膜炎的生物标志物。

Kohli等[37]对Cochrane数据库最近的研究进行了荟萃分析，旨在确定GeneXpert MTB/RIF对肺外结核的诊断准确性，并评估肺外结核患者对利福平的耐药性。研究共纳入66项研究，对16 213份肺外标本进行了GeneXpert MTB/RIF检测。与结核分枝杆菌培养阳性者比较，结核性胸膜炎患者GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度和特异度分别为50.9%(39.7%～62.8%)和99.2% (98.2%～99.7%)。由此得出结论，结核性胸膜炎患者胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度低，特异度高，阳性有助于结核性胸膜炎的诊断，同时检测利福平耐药也很准确。

总之，GeneXpert MTB/RIF在胸腔积液中的敏感度低，在临床实践中对结核性胸膜炎诊断的应用价值有限。

2. miRNA：目前针对结核性胸腔积液与其他类型胸腔积液，应用miRNA定量检测进行鉴别诊断的研究相对较少，大部分数据来源于恶性胸腔积液特异性miRNA的研究，其中大多将结核性胸腔积液与其他类型胸腔积液合并为良性胸腔积液，与恶性胸腔积液进行鉴别诊断。

miR-198在恶性胸腔积液中的表达明显低于结核性胸腔积液和炎性胸腔积液，与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和细胞角蛋白19的片段(cytokeratin 19 fragment antigen，Cyfra21-1)联合后效果更好。焦昕和刘宁[38]的研究发现，结核性胸膜炎患者胸腔积液和血清中 miR-29a 和 miR-144 的表达明显高于恶性胸膜疾病患者，而且在抗结核治疗后表达下调，提示临床上定量检测血及胸腔积液中miR-29a和miR-144的水平，可能有助于鉴别诊断结核性胸腔积液和恶性胸腔积液，并可用于判定结核病的活动性。来自不同体液和细胞的研究结果提示，miR-29和miR-144可作为结核性胸膜炎诊断的潜在标志物。各项研究中发现的miRNA种类不同，可能与各研究纳入的组别不同有关[39-41]。

目前尚无确定的、商业化的 miRNA 组合用于临床诊断，可能与胸腔积液中 miRNA 含量低、定量检测技术待优化以及尚无研究开展基于大样本的筛选和验证导致样本覆盖程度不足等原因有关。相对于细胞或组织而言，依靠现有技术鉴定获得的胸腔积液miRNA种类相对较少，表达量也相对较低，给胸腔积液特异性miRNA的筛选和鉴定带来了一定的困难。但随着二代测序技术的发展甚至是三代测序技术的应用，胸腔积液miRNA的测序深度会越来越高；敏感度更高的数字PCR的应用也将极大提高胸腔积液miRNA 的检出率；目前已有公司研发的miRNA预扩增试剂盒可以实现对低表达量miRNA的检测[42]。相信随着这些技术的不断进步，胸腔积液miRNA定量检测方法将会越来越简化。此外，对于现已筛选获得的特异性miRNA在结核性胸膜炎发生和发展中的作用机制仍然未知。因此，尚需要设计大样本量的横向和纵向研究，阐明miRNA在疾病中的调节机制和作用，以确保特异性miRNA在结核性胸膜炎鉴别诊断中的可靠性和实用性。

三、总结与展望

尽管结核性胸膜炎的实验室研究已经取得了很大进展，但目前尚无确诊结核性胸膜炎的独立生物标志物检测方法。ADA和IFN-γ具有良好的敏感度和特异度，可作为结核性胸膜炎的特定生物标志物；IL-27是一种很有前途的生物标志物。然而，在常规试验中加入IL-27和IFN-γ检测，会增加试剂和分析成本，不利于在基层临床实验室广泛使用。我们已进入应用NAATs和GeneXpert MTB/RIF进行结核病诊断的分子检测时代，虽然这些检测技术对结核病和耐多药结核病有很大的价值，但它们在结核性胸膜炎诊断方面的性能还不尽如人意。目前尚无确定的、商业化的miRNA组合用于临床诊断，可能与胸腔积液中miRNA含量低、定量检测技术待优化等原因有关。今后的研究重点将聚焦于炎症反应不同阶段的潜在生物标志物的联合诊断、基因测序技术的更新等方面。考虑到我国为结核病高负担国家，未来的挑战仍是开发出具有高效、低价、易操作的实验室检测方法，便于基层广泛开展。