儿童结核病分子生物学诊断方法研究进展

焦伟伟

2019年，全球估算新发儿童结核病患者约120万例，但实际上报例数不足50%，诊断困难是其主要影响因素[1]。对儿童结核病患者及时有效的诊断有助于早期干预治疗，可明显改善患儿预后。但与成年人相比，儿童咳嗽反射较弱，难以获取合格的痰标本；加之结核病患儿痰标本细菌载量较低，病原学阳性检出率低，极大地制约着临床诊断工作的开展。近年来，随着分子生物学检测技术的飞速发展，新型结核病诊断方法不断涌现，我国新的行业标准《WS 288—2017肺结核诊断》也将分子生物学检测纳入到结核病的确诊标准中，可见其对结核病的诊断具有重要应用价值。笔者现针对这些新型诊断方法在儿童结核病诊断中的应用进行综述。

一、GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)

GeneXpert是以结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)的RNA聚合酶活性位点编码区(81 bprpoB核心序列)为靶标，采用半巢式实时半定量PCR进行病原体检测的方法。由于95%以上的利福平耐药MTB菌株在rpoB核心区发生核苷酸变异，因此，该方法可同时检测MTB对利福平的耐药情况。

随着GeneXpert在儿童人群中应用研究的不断增多，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)在2014年公布的数据显示，在儿童肺结核诊断中，GeneXpert检测咳出痰、诱导痰或胃液标本的敏感度相近，均高于40%，特异度也较高，约为93%～100%；且对儿童痰液和胃液的检测敏感度分别高于抗酸染色37%和44%，其中，对抗酸染色阳性患儿的检测敏感度可达95%，对抗酸染色阴性患儿的检测敏感度也达到55%～62%；以MTB培养为金标准，GeneXpert检测痰液和胃液的总敏感度和总特异度约为66%和98%[2]。同年，《儿童结核病管理指南(第2版)》[3]中对GeneXpert的临床应用也给出了较为明确的建议：对于临床疑似肺结核患儿、耐多药肺结核患儿，GeneXpert可先于抗酸染色或细菌培养作为初筛方法；病原学阳性结果对于疑似肺结核、耐多药肺结核、肺结核并发HIV感染、肺结核与其他疾病鉴别诊断，以及复治肺结核患儿的诊断具有重要价值。这说明GeneXpert对儿童结核病的诊断具有较好的临床应用价值。然而，2015年的一项荟萃分析指出，尽管GeneXpert检测培养阳性结核病患儿痰标本具有较好的敏感度，但检测培养阴性患儿痰标本的敏感度仅为2%[4]。这提示对儿童结核病的诊断亟需更加敏感的检测方法。

二、超敏结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测方法(GeneXpert MTB/RIF Ultra)

2017年3月24日第22个世界防治结核病日，WHO推荐了新一代GeneXpert MTB/RIF Ultra检测技术[5]。相对于GeneXpert技术，该方法新增了IS6110和IS1081多拷贝序列分子靶标，扩大了DNA扩增体积(由GeneXpert的25 μl 体系增加至50 μl体系)，并采用全巢式PCR扩增、更加快速的热循环、改良的流体力学和酶，明显提高了检测敏感度，检出限可达16 CFU/ml(GeneXpert的检测限为114 CFU/ml)；对检测MTB菌量较少的标本具有更优越的性能，尤其是涂阴标本和儿童结核病标本。

一项评估GeneXpert MTB/RIF Ultra检测儿童肺结核效能的多中心研究结果显示，GeneXpert MTB/RIF Ultra和GeneXpert对儿童第1份痰标本检测的敏感度分别为64.3%和53.6%，特异度分别为98.1%和100.0%[6]。而我国采用该技术进行儿童结核病的多中心研究结果显示，GeneXpert MTB/RIF Ultra对结核病患儿支气管肺泡灌洗液标本检测的敏感度和特异度分别为70%和98%，且敏感度高于GeneXpert约13%；同时，对培养阳性和阴性患儿的检测敏感度分别为91%和58%[7]。在对胃液标本进行检测时，GeneXpert MTB/RIF Ultra对所有结核病患儿、病原学阳性患儿和临床诊断患儿检测的敏感度分别为60.5%、87.5%和44.4%；且对4岁以下患儿胃液标本的检出率更高(80.0%)[8]。因此，WHO推荐的适用于GeneXpert检测的临床应用范围也适用于GeneXpert MTB/RIF Ultra，可用于初始诊断具有结核病症状的患儿。

此外，考虑到儿童标本获取的便捷性，有学者把目光转向了更易获取的标本，如粪便、鼻咽吸取物和尿液。来自孟加拉国的一项纳入447例患儿的研究表明，以痰标本细菌学阳性为参考标准，GeneXpert MTB/RIF Ultra检测粪便标本的敏感度和特异度分别为58.6%和89.7%，而GeneXpert分别为37.9%和100.0%[9]。我国上海的一项研究也取得了相似的结果，即以临床综合诊断结果作为参考，GeneXpert MTB/RIF Ultra检测呼吸道和粪便标本的敏感度分别为52.0%和45.5%[10]。另一项对195例南非患儿鼻咽吸取物和诱导痰标本的研究发现，GeneXpert MTB/RIF Ultra检测1份鼻咽吸取物和1份诱导痰标本的敏感度为46.0%和74.3%，而同时检测这2份标本的敏感度可达80%；若同时检测2份鼻咽吸取物，则敏感度为54.2%，而同时检测2份鼻咽吸取物和1份诱导痰标本，则敏感度高达87.5%[11]。由此可见，尽可能检测多份同一类型或同时检测不同类型标本可提高该方法对儿童结核病的诊断效率。需要注意的是，检测尿液标本对泌尿系结核患儿的诊断具有一定的价值，但对肺结核患儿的诊断没有帮助[12-13]。

三、基于恒温扩增技术的结核病诊断方法

恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的新型体外核酸扩增技术，具有快速、高效、特异的优点，且无需专用设备。目前已发展出较多基于该技术的结核病诊断方法，主要有环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重组酶聚合酶扩增 (recombinase polymerase amplification，RPA)、多交叉置换恒温扩增(multiple cross displacement amplification, MCDA)等。但相关技术在儿童结核病诊断中的应用研究较少，需进一步评估其临床价值。

2016年，WHO发布了《TB-LAMP在肺结核诊断中的应用》[14]，对全球7个国家5年内的研究数据进行了总结和评估，建议在诊断疑似肺结核患者时，TB-LAMP技术可替代或作为痰涂片镜检的补充方法，尤其是痰涂片镜检阴性时。随后的一项荟萃分析结果显示，以培养结果为参照，TB-LAMP检测结核病的汇总敏感度和特异度分别为77.7%和98.1%，其中，检测涂片阴性患者的汇总敏感度为42.1%[15]，提示在结核病高负担地区TB-LAMP具有较好的诊断能力。但TB-LAMP的检测结果多是依靠肉眼进行浊度或荧光亮度的判断，存在一定的主观性。为避免这一缺陷，Ai等[16]建立了基于RPA结合成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的结核病快速检测方法。该方法依靠gRNA特异性识别靶序列后经Cas12a剪切产生荧光信号进行检测，达到了几乎单拷贝的敏感度，且所需样本量少。采用成年人结核病临床样本进行验证时，发现采用CRISPR-MTB对总体患者进行检测的敏感度(79%)高于培养(33%)和GeneXpert(66%)，特异度高达98%；而对肺结核患者痰标本和结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测时，CRISPR-MTB、GeneXpert和培养的敏感度分别为90%、75%、41%和73%、54%、23%；但对其他肺外结核标本检测时，CRISPR-MTB与GeneXpert的敏感度相近，在软组织脓液标本中达到100%，在尿液和浆膜腔液标本中达到55%。这提示随着检测技术敏感度的提高，脓液标本的检出率得到了极大的提升。

笔者建立了一种基于MCDA的MTB检测方法，该方法以多拷贝序列(IS6110和IS1081)为双靶标，除了具备TB-LAMP 的优势外，还提升了检测的敏感度和反应速度。研究中采用基于纳米颗粒的横向流动生物传感器进行检测，结果显示：MCDA对所有结核病患者检测的敏感度为88.2%，高于液体培养(42.0%)和GeneXpert(49.6%)；尤其对培养阴性标本检测的敏感度高达81.2%，远高于GeneXpert(23.2%)，显示出较好的临床应用前景[17]。

四、宏基因组测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)

随着高通量测序技术的发展和普及，其在临床微生物检测领域中也发挥了重要作用。mNGS是其最常用的方法，是直接对提取自临床标本的全部微生物核酸进行无差别和无选择性的大规模测序，再将序列信息与已知微生物数据库比对分析，从而判断样本中微生物的种类和含量。mNGS对培养困难的病原体(如MTB)具有明显优势。已有报道显示，mNGS在肺结核(痰和灌洗液标本)和肺外结核(脑脊液和脓液标本等)的诊断中均具有较高的敏感度[18-21]。上海市肺科医院的一项研究评估了mNGS在结核性脑膜炎诊断中的应用价值，研究共纳入45例结核性脑膜炎患者和6例对照患者，以最终临床诊断为参考，mNGS的检测敏感度为84.44%，高于液体培养(22.2%)和GeneXpert(40%)[21]，且特异度为100.00%，提示mNGS可明显提升结核性脑膜炎患者的病原学确诊率，具有较好的应用前景。Zhao等[20]采用mNGS检测骨关节感染患者的脓肿标本，发现mNGS不仅可检出全部的骨结核患者，还可以在治疗失败的患者中检测到MTB与其他病原体的混合感染，对于临床治疗具有指导意义。目前，mNGS研究中虽然纳入了部分儿童患者，但尚未有大样本量且针对儿童不同类型标本的应用评估，需进一步研究。

五、宿主基因表达谱

近年来，基于宿主的结核病诊断方法也越来越受到关注，研究较多的是MTB感染后机体基因表达水平的变化，其中多数与结核病预测、诊断和疗效监测的基因组合相关。Zak等[22]在南非和冈比亚青少年(12～18岁)MTB感染队列中定期监测了全血RNA水平的变化，发现了可预测活动性结核病的16个基因组合，敏感度和特异度分别为66.1%和80.6%。Anderson等[23]分析了来自非洲的2955例疑似结核病患儿全血中的mRNA表达水平，明确了与结核病患儿相关的51个mRNA表达改变，并以此建立了一个诊断评分系统；该评分系统诊断结核病的敏感度和特异度分别为82.9%和83.6%，而GeneXpert检测的敏感度为54.3%。Sweeney等[24]利用公共基因表达芯片数据库，比较了结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)者或其他疾病者与活动性结核病患者的基因表达差异，建立了基于3个基因(GBP5、DUSP3和KLF2)表达水平的诊断体系，并在10个国家的儿童和成年人数据中进行了验证，结果显示该诊断体系区分活动性结核病与健康对照者、LTBI者和其他疾病者的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)分别为0.90、0.88和0.84；并证明了这3个基因的表达不受HIV感染、细菌耐药性或卡介苗接种的影响；且在活动性结核病患者治疗期间，基于这3个基因的总评分会下降，提示该体系不仅对活动性结核病具有很好的诊断价值，也对治疗监测方面具有潜在的应用价值。尽管宿主基因表达模型在结核病预测、诊断和治疗监测方面表现出了良好的敏感度和特异度，但也有学者指出宿主的基因表达水平与其性别、年龄和MTB感染状态等因素密切相关[25]，需进一步细化研究以寻找适合儿童结核病诊断的最佳基因组合。

六、 问题与不足

由于目前不同的研究中采用不同的诊断方法，检测的敏感度差异较大，同时也缺乏采用多种分子诊断技术对同一批标本进行检测的大型研究，使得各种检测方法不具备可比性。另外，文中涉及的方法均是近年来比较新的技术，除GeneXpert外，大多尚处于研究阶段，临床可及性并不好，难以比较各方法检测的实用性或阳性率高低的意义。又由于结核病患儿标本采集比较困难，使得新型诊断方法一般先通过成年人的研究验证后，方可推广到儿童患者中，如文中基于恒温扩增技术的结核病诊断方法和mNGS测序技术等虽在成年人结核病诊断中显示了良好的应用前景，但缺乏在儿童样本中的研究数据，尚需要进一步研究来验证其相关诊断效能。

综上，分子生物学诊断技术极大地提高了儿童结核病的检出效率。敏感度高、特异度强、快速、经济、便捷，以及标本类型易采集且可多次重复检测的分子诊断方法，是儿童患者亟需的最佳诊断方法。临床医生可根据不同诊断方法的可及性、特点及价格等方面进行综合选择，以有效发挥其在儿童结核病诊断中的价值。