GeneXpert MTB/RIF在膝关节结核诊断及利福平耐药检测中的应用价值

王连波 章志华 刘丰胜 贾晨光 董昭良 姚晓伟 吴树才

膝关节结核是临床中常见的骨关节结核，若结核病灶破坏关节面及软骨，常会遗留关节活动障碍、关节毁损等并发症。疾病治疗关键是早发现、早治疗，常见的治疗方案是抗结核药品联合病灶清除手术，其中，用药是基础。因此，检测结核分枝杆菌有无耐药性及抗结核药品的选择至关重要。膝关节结核标本含菌量较低，关节液涂片查抗酸杆菌阳性率及关节液或病灶组织结核分枝杆菌培养阳性率均偏低，且耗时长，极易造成漏诊、误诊，且不能早期检测耐药性，容易延误病情[1]。近几年，GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测技术广泛应用于肺结核患者痰液标本的检测，具有耗时短、敏感度与特异度高及生物安全性好等优点，自2013年起被世界卫生组织(WHO)推荐应用于肺外结核的诊断[2]。但GeneXpert在膝关节结核临床标本检测中的可行性及准确性，目前尚无相关报道。笔者应用GeneXpert、抗酸染色及结核分枝杆菌快速培养等3种方法，对66例疑似膝关节结核患者病灶脓液标本进行检测及比较，评估GeneXpert在膝关节结核早期诊断及利福平耐药性检测中的临床应用价值。

对象和方法

1.研究对象：搜集2015年7月至2019年3月河北省胸科医院收治的66例疑似膝关节结核患者的临床资料，其中，男32例，女34例；年龄范围26～73岁，平均年龄(51.0±6.1)岁；左膝关节36例，右膝关节30例；3例并发窦道形成。参照诊断标准，66例研究对象中44例诊断为膝关节结核，22例诊断为非结核性膝关节感染。

2.诊断标准[3]：(1)病变脓液结核分枝杆菌培养阳性。(2)病理结果回报示干酪样坏死、肉芽肿性病变伴坏死。(3)影像学检查，包括X线摄片、CT扫描、MRI等，符合典型结核病表现。(4)抗结核药品治疗有效。符合上述任何一项即临床诊断为“膝关节结核”，均不符合者诊断为非结核性膝关节感染。

3.标本采集：研究对象于术中取脓液标本，分别行涂片抗酸染色、GeneXpert检测及 BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养系统快速培养及检测，培养阳性者行改良罗氏绝对浓度法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)检测耐药性；同时，取病灶肉芽组织送病理检测。

4.病灶清除术：研究对象均术前进行常规抗结核药品治疗[异烟肼0.3 g 口服，1 次/d；利福平0.45 g 静脉滴注，1 次/d；吡嗪酰胺0.5 g 口服，3次/d；乙胺丁醇0.75 g 口服，1 次/d]，治疗时间为2～4周。手术均采用椎管内麻醉，采用膝关节前侧切口，术中切除肥厚滑膜、死骨、肉芽组织及关节软骨表面的病变组织等；术中根据膝关节骨质破坏情况可予以植骨，创腔放置冲洗管及引流管各1根，持续创腔冲洗治疗，术后冲洗时间为7～14 d。

5.实验室检测：(1)抗酸染色：于3 d完成脓液标本处理，按照操作规程进行标本抗酸染色镜检。(2)GeneXpert检测：取1 ml脓液标本并加入2 ml标本处理液，轻微混匀后按照操作规程，行结核分枝杆菌检测及利福平耐药检测。(3)BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养：取脓液标本2 ml，按照操作说明书进行前处理，液体培养时间设定为45 d，培养阳性的标本采用改良罗氏绝对浓度法行12种抗结核药品药敏试验。

6.统计学处理：应用SPSS 21.0软件进行数据分析，计数资料以“率(%)”表示。以临床诊断结果为参照，计算GeneXpert检测、抗酸染色、液体培养法的敏感度和特异度。

结 果

1.各方法检测结果：66份标本中，液体培养阳性25份，阴性41份。在25份培养阳性的标本中，4份对利福平耐药，21份对利福平敏感。涂片抗酸染色阳性14份，阴性51份。GeneXpert检测阳性35份，阴性31份，4份对利福平耐药。

2.检测效能：以临床诊断结果为参照，GeneXpert检测、抗酸染色及液体培养的敏感度分别为75.0%(33/44)、29.5%(13/44)、52.3%(23/44)；特异度分别为90.9%(20/22)、95.5%(21/22)、90.9%(20/22)。

3.利福平耐药检测： 25份培养阳性的标本中，4份药敏试验显示对利福平耐药，GeneXpert亦检出发生rpoB基因突变。

讨 论

2020年《关节结核与耐药诊断专家共识》中将膝关节结核分为结核性滑膜炎、早期关节结核、晚期关节结核和毁损期关节结核[4]，对于结核性滑膜炎一般可采取单纯药物治疗，配合局部给药或者关节腔冲洗治疗，一般可获得满意效果。但当进展为早期关节结核或者滑膜结核反复产生关节液，则可采取手术治疗。对反复发作的滑膜结核可采取关节镜手术去除肥厚滑膜，但对于进展为晚期关节结核时，则需要开放手术行关节病灶清除术，若结核平稳，规律抗结核药品治疗前提下还可以尝试一期关节置换或二期置换术。若发展为毁损期关节结核，则一般需要行关节融合术，将严重降低患者生活质量。因此，早期明确结核分枝杆菌感染及根据有无耐药性调整抗结核药品治疗方案至关重要。传统的结核分枝杆菌检测方法有病变组织病理检查、脓液送检抗酸涂片及罗氏培养基培养等，但阳性检出率较低，且耗时长。不能早期明确诊断及检测耐药性，往往是膝关节结核进展得不到控制的根本原因。且膝关节病灶处结核分枝杆菌含量少，因此，抗酸染色、罗氏培养、结核分枝杆菌快速培养的敏感度均低，且病变组织的病理检查常提示慢性炎症、肉芽组织，极易造成漏诊或延误诊断。

GeneXpert检测操作简单，耗时短，既可检测结核分枝杆菌，又能检测利福平耐药基因突变。其以PCR技术为基础，针对rpoB基因 81 bp 利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而检测是否为结核分枝杆菌及是否对利福平耐药(rpoB序列存在突变)。GeneXpert技术的标本盒为相对密闭的系统，可减少对外界的污染，大大提高生物安全度，且整个过程只需2 h。GeneXpert检测肺外结核标本的敏感度为87.3%～95%，特异度为97%～100%[5-6]，但对膝关节关节液研究较少。本研究采用统一的膝关节病灶脓液标本，以临床诊断为参照标准，评价了GeneXpert检测膝关节结核患者脓液标本的诊断效能。结果显示，GeneXpert检测膝关节结核脓液标本的敏感度为75.0%，特异度为90.9%，且能在2 h内获得结果，同时提供利福平耐药基因突变信息。在结核分枝杆菌液体培养阳性的25份标本中，GeneXpert检出17份。出现阴性的原因可能为：经过2～4周抗结核药品治疗后膝关节结核病灶脓液标本中菌含量减少、标本中结核分枝杆菌复合群DNA基因中ropB降解[7-9]。

本研究结果显示，GeneXpert检测敏感度高于液体培养和抗酸染色，加之其可在2 h内获得检测结果，可见其在膝关节结核的早期诊断上有较高的应用价值。GeneXpert既可检测结核分枝杆菌，又可对利福平耐药性进行检测。早期单纯滑膜结核不典型，不易与普通滑膜炎区分，且一般采取单纯药物治疗，容易造成误诊，常用检测手段时间长且检出率低，抽关节液进行GeneXpert检测，可短期内明确诊断及检测利福平耐药性，指导化疗方案。