重视结核分枝杆菌分子生物学诊断

吴树才 章志华 邸红芹

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染性疾病，是全世界十大死因之一，被列为我国重大传染病之一。2010年第五次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国15岁及以上人群中，活动性肺结核患病率为459/10万，其中痰涂片阳性率为66/10万[1]。WHO[2]全球结核病报告显示，2019年全球新发结核病患者约996万例，结核病发病率为130/10万，30个结核病高负担国家的新发患者数占到了全球患者数的86%，其中印度(26%)、印度尼西亚(8.5%)、中国(8.4%)、菲律宾(6.0%)、巴基斯坦(5.7%)、尼日利亚(4.4%)、孟加拉国(3.6%)和南非(3.6%)等8个国家的新发患者约占全球患者数的2/3。此外，全球估算利福平耐药结核病患者数约46.5万例，其中耐多药结核病约占78%。我国仍然是结核病高负担国家，面对如此严峻的形势，早期、快速和准确地诊断MTB感染是至关重要的。然而，常规的诊断方法如痰MTB培养虽然能够诊断，但培养时间长，敏感度低；痰涂片染色操作复杂，阳性检出率低，且不能鉴别非结核分枝杆菌感染[3-4]。

随着近年来分子生物学诊断技术的发展，分枝杆菌的检测、鉴定技术也取得巨大的进展。目前应用报道多为核酸检测技术(nucleic acid amplication tests，NAAT)，通过检测MTB特异性的基因片段，判定标本中是否存在MTB，为结核病早期快速诊断提供了新的途径。2017年，我国已将MTB核酸检测阳性作为肺结核诊断标准之一，这将会提升我国结核病诊疗的整体水平[5]。为充分了解分子生物学检测技术在结核病诊断中的作用，笔者对目前应用的分子生物学检测技术进行阐述。

一、实时荧光定量PCR检测技术

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)最早由Higuchi等[6]提出，随后美国PE(Perkin Elmer)公司研发出了TaqMan荧光探针定量技术，真正做到了“实时检测”。与传统的PCR技术相比，具有特异度高、重复性好、操作简单以及无常规PCR扩增后开管操作等优点。实时荧光PCR技术目前在临床应用较为广泛，常规实时荧光定量PCR以MTB IS6110(特异性插入序列)为检测靶点，用于检测MTB或非结核分枝杆菌感染，具有较高的敏感度和特异度[7]。

2009年美国Cepheid公司研发的MTB及利福平耐药检测试剂盒(GeneXpert MTB/RIF, 简称“Xpert”)，开始用于结核病及耐药检测。该方法基于半巢式实时荧光定量PCR技术，以MTB特异性序列rpoB基因上的利福平耐药相关核心区域(RRDR)为靶点，自动提取扩增，实现MTB及其对利福平耐药性的快速检测，报告周期为2 h[8]。由于其具有快速可靠、安全性好、不易受污染等优点，2013年WHO推荐Xpert作为成人和儿童耐多药结核病或并发HIV感染的首选检测方法。陈蕾和吴桂辉[9]以药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果为金标准，测得Xpert检测MTB敏感度为84.80%，特异度为98.82%，说明该技术在检测MTB方面具有较高的敏感度和特异度。Meta分析显示，Xpert检测结核性胸腔积液的敏感度和特异度分别为51.4%和98.6%，提示在结核性胸腔积液诊断中具有低敏感度和高特异度，表明该检测方法具有一定的局限性[10]。

GeneXpert MTB/RIF Ultra(简称“Xpert Ultra”)是在Xpert基础上进一步改进，旨在提高检测敏感度。Xpert Ultra以IS6110和IS1081为检测靶点，同时与Xpert相比，MTB的检测阈值为15.6 CFU/ml，是Xpert敏感度的10倍，因而对含菌量少的标本(如肺外结核、艾滋病并发结核病、儿童结核病等)的敏感度更高[11]。一项纳入21例临床诊断为疑似中枢神经系统MTB感染的非HIV感染患者的研究显示，Xpert Ultra检测阳性率(66.7%)显著高于Xpert(26.7%)和液体培养(26.7%)阳性率；Xpert Ultra用于脑脊液诊断结核性脑膜炎的敏感度和特异度分别为66.7%和100.0%[12]，证实Xpert Ultra是目前诊断结核性脑膜炎最敏感的方法，相比之下，Xpert Ultra相对Xpert有更好的临床应用意义。

二、恒温扩增检测技术

近年来，随着对体内DNA、RNA的合成过程以及一些辅助蛋白作用机制的不断深入研究，在恒温条件下扩增目的片段的技术应运而生，且表现出极大的优势。该技术不需要专用的设备，仅需金属浴或保温箱即可进行检测；对标本要求低，可以耐受一些PCR反应的抑制剂，标本无需经过复杂的核酸提取过程即可进行扩增；敏感度和特异度与PCR技术差异无统计学意义；此外在恒温条件下，反应时间更短。目前MTB诊断主要为：环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术、交叉引物恒温扩增(crossing priming amplification，CPA)技术及实时荧光恒温扩增(simultaneous amplification and testing，SAT)技术。

(一)LAMP技术

LAMP技术是Notomi[13]于2000年研究的一种基于具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的核酸体外恒温扩增新技术，该技术针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，依赖链置换Bst DNA聚合酶，在恒温(60～65 ℃)条件下实现高效、特异的靶序列的扩增。LAMP检测时不需要专门的核酸扩增设备，通过肉眼观察即可判定检测结果；对操作人员技术水平要求低；敏感度和特异度较高，适合在基层实验室进行推广应用。刘权贤等[14]评估LAMP法在肺结核患者痰液标本中的应用，对于抗酸阳性标本，检出率为100.0%(75/75)，而在抗酸染色阴性标本中阳性检出率为31.9%(23/72)，均显著高于L-J固体培养。欧喜超等[15]以固体培养试验结果为标准，显示LAMP的敏感度和特异度分别为90.24%(333/369)和96.86%(924/954)，涂片阴性患者中检测敏感度和特异度分别为82.52%(170/206)和97.06%(924/952)，该方法可用于早期发现结核病患者。虽然LAMP技术有诸多的优点，但缺点也明显，如在高温和高湿等环境下会导致假阳性率升高；不能区分肺结核处于活动期还是潜伏期，即不能监测患者的诊疗效果。

(二) CPA技术

CPA技术由杭州优思达生物技术有限公司研发，为中国首个具有自主知识产权的体外核酸扩增技术[16]。该技术以MTB复合群特异性的IS6110插入序列为靶序列，通过两对特异性扩增引物、一对特异性探针，以及Bst的DNA聚合酶，在恒定温度条件下，一次性完成MTB复合群IS6110片段的特异扩增和杂交过程，然后在密闭的一次性核酸检测装置中利用免疫层析乳胶标记试纸条检测技术，定性检测特异性扩增产物，检测敏感度为10个病原体，操作简便快速，摆脱了分子生物学诊断对昂贵仪器和高要求实验室的依赖。CPA的检测性能评估显示，该方法的敏感度和特异度分别为98.94%和92.31%，显著高于痰涂片和痰培养，说明CPA是一种痰涂片镜检很好的补充检测，可以提高痰涂片阴性标本MTB的检出率，尤其适用于基层医院MTB的快速筛查[17]。

(三)SAT技术

SAT技术以MTB 16Sr RNA为检测靶标，基于M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，在恒温(42 ℃)条件下进行实时荧光扩增检测[18]。该技术采用了RNA扩增方式进行检测，标靶和扩增物均是RNA，因而有极高的扩增效率且反应稳定，可快速鉴别结核病患者是否处于活动期。柴国祥等[19]对400例疑似肺结核患者标本进行SAT检测，敏感度和特异度分别为72.68%和98.62%；以临床诊断为金标准，SAT检测的符合率(86.75%)显著高于痰培养(69.75%)和痰涂片(67.50%)。金玄俊等[20]通过对比涂片抗酸染色、L-J固体培养、液体培养和SAT检测MTB阳性率评估SAT技术的临床应用价值，结果显示SAT检测阳性率(51.7%，137/265)显著高于涂片抗酸染色(31.3%，83/265)、L-J固体培养(38.9%，103/265)和液体培养阳性率(43.7%，116/265)，表明SAT检测技术具有快速、简便和准确等优势，值得用于结核病实验室辅助诊断。

三、MTB耐药检测技术

(一) 基因芯片技术

基因芯片(gene chip)是一种基于核酸杂交技术的高通量DNA检测技术，将含有荧光标记的PCR扩增产物与包被有特异性DNA探针的芯片杂交，通过检测分析杂交信号的强度即可获知样品信息。Pang等[21]研究纳入1814例患者标本，以药敏试验为金标准，结果显示基因芯片法检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为87.56%和97.95%；检测异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为80.34%和95.82%，表明该技术是一种高效、快速、安全的检测方法，值得广泛应用。杨映晖等[22]对933例疑似肺结核患者晨痰标本进行基因芯片法检测分析，结果显示基因芯片法检测出异烟肼耐药的敏感度为86.67%(26/30)，特异度为96.53%(195/202)，表明基因芯片法敏感度、特异度较高，有助于结核病的早期诊断及防控。

(二) 线性探针技术

线性探针技术(line probe assay)是一种基于核酸反向杂交技术，将带有生物素标记的目的片段与固定于杂交膜上的特异性寡核苷酸探针杂交，根据酶联免疫显色结果，判定杂交结果。2008年WHO批准该技术可用于耐多药结核病的筛查。基于线性探针技术原理，德国HAIN公司推出GenoType MTBDR和MTBDRsl检测试剂盒，可以用于快速检测一线以及氟喹诺酮类及二线注射药物耐药。一项评估线性探针技术对耐药肺结核诊断准确性的Meta分析显示，线性探针技术诊断耐利福平、异烟肼、耐多药、氟喹诺酮、二线注射类药物(包括卡那霉素、卷曲霉素、丁胺卡那霉素)以及广泛耐药肺结核的敏感度分别为91.0% (88.0%～94.0%)、80.0%(77.0%～83.0%)、81.0%(76.0%～85.0%)、92.0%(88.0%～95.0%)、79.0%(58.0%～91.0%)和46.0%(19.0%～75.0%)，特异度分别为98.0%(97.0%～99.0%)、98.0%(96.0%～99.0%)、99.0%(99.0%～100.0%)、94.0%(91.0%～97.0%)、98.0%(90.0%～100.0%)和100.0%(98.0%～100.0%)，表明线性探针技术对耐药肺结核的诊断准确性较高[23]。

由于可同时检测的靶点多、检测效率高且检测成本较低，基于核酸分子杂交的结核病诊断和耐药检测技术仍获得了较多研究者和临床实验室的青睐，如基于PCR 扩增和核酸杂交芯片的Truenat MTB检测，已经开发出反射测定法来检测MTB阳性结果的样品对利福平的耐药性，印度医学研究委员会根据当地数据向印度中央结核病司推荐了Truenat MTB，并获得了WHO 技术验证和推广[2]。

(三)高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)技术

HRM技术是一种基于实时荧光定量PCR和熔解曲线分析相结合的新技术，直接检测扩增产物中饱和荧光染料荧光强度变化。由于靶序列中不同GC碱基含量和分布不同，DNA分子变性温度(Tm)不同，会形成特殊的熔解曲线形状和位置，通过比较解链温度曲线与标准曲线的差异，即可准确区分野生型与突变型基因，可以区分单个碱基的序列差异。李春燕等[24]以药敏试验为金标准，纳入200例痰涂片阳性患者标本，测得HRM技术在初治患者中检测异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为71.43%和96.77%，检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为80.00%和97.92%；在复治患者中，检测异烟肼耐药的敏感度为35.00%，特异度为81.25%，检测利福平耐药的敏感度为82.35%，特异度为94.74%，表明HRM技术检测快速、高效，可用于初治和复治患者利福平、异烟肼耐药性的检测，并指导临床用药。HRM技术性能研究显示，异烟肼的敏感度和特异度分别为95.00%和82.76%[25]。目前基于HRM技术的国产商品化检测试剂盒已逐渐用于结核病耐药性检测领域，并且国家“十二五”科技重大专项已对该技术开展多中心临床研究。

四、其他新型检测技术

(一) DNA测序技术

DNA测序技术是检测基因突变最直接、最可靠的方法，目前随着测序技术的日益成熟，多种生物信息学平台均可实现MTB耐药快速、精准的诊断。辜吉秀等[26]纳入135株菌株以比例法药敏试验结果为参考标准评价二代测序(next generation sequencing, NGS)技术在耐药结核病中的检测效能，结果显示NGS技术检测异烟肼、乙胺丁醇、利福平、链霉素及氧氟沙星耐药的敏感度分别为88.75%、85.71%、84.72%、73.91和68.97%，特异度分别为100.00%、86.84%、96.83%、96.97%和99.06%，提示NGS技术检测利福平、异烟肼及氧氟沙星等耐药效果较好，能够满足临床结核病诊断需要，但对乙胺丁醇和链霉素已知耐药位点检测性一般，需要对其耐药机制进一步研究。尽管测序法检测结果可靠，但在结核病耐药诊断过程中仍然存在一些挑战，测序仪器以及测序费用昂贵；缺少专家共识和指南用于规范测序操作，以及制定标准化步骤，因此在临床上还难以推广。

(二)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)

MALDI-TOF-MS是一种新型的软电离生物质谱，适用于混合物和生物大分子的测定。该技术原理是用激光照射样品与基质形成共结晶薄膜，使基质晶体升华进入气相，根据质荷比与飞行时间，得出质谱峰图，之后对比参考图谱即可辨别样本分子。王蔚等[27]以测序为金标准，评估MALDI-TOF-MS对液体培养分枝杆菌菌种鉴定的能力，结果显示MALDI-TOF-MS鉴定MTB和非结核分枝杆菌准确率分别为95.65%和88.46%，表明该方法是一种快速、简便准确的鉴定方法，在临床应用中具有重要价值。一项纳入11篇文献的Meta分析显示，MALDI-TOF-MS鉴定分枝杆菌正确率为91%，其对分枝杆菌属的鉴定有较好的准确性[28]。

五、展望

我国现阶段仍是结核病的高负担国家，早期、快速、精确的诊断方法将会发挥越来越重要的作用。近年来，MTB的检测正由传统的细菌学检查转向分子生物学诊断等更为精确的方法。但分子生物学检测也存在一些局限性。首先，菌株的突变呈现地域性的差异，商品化的检测试剂仅覆盖了常见的检测位点，单独的运用分子生物学检测势必造成对部分带有其他位点的菌株的漏检；导致其检测敏感度不高，因此仍然要综合实验室其他检测。近年来，全基因组测序技术广泛运用，由于其具有高通量，涵盖基因全等优势，其用于MTB的检测具有很大的潜力；其次，基因突变和表型耐药仍有一些差别，基因突变不一定存在表型耐药，分子生物学检测应结合培养等传统的细菌学证据；最后，实验室开展分子生物学检测需具备一些硬件条件，通常实验室应具有临床基因扩增的资质及标准的实验室分区，因此限制了部分检测技术在基层的使用。

虽然分子诊断存在诸多挑战，但随着分子诊断技术研究的不断深入和进步，将会在结核病诊断中发挥越来越重要的作用，对结核病的诊疗、防控具有深远意义。