实验室诊断技术在耐药结核病中应用价值的若干思考

张治国 郭海萍 逄宇

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的慢性传染性疾病。据世界卫生组织(WHO)[1]报告，全世界每年约有1000万人罹患结核病，约140万人死于结核病，也是传染病中致死人数最高的疾病。耐药结核病加剧了结核病防控工作的难度，导致临床治疗更加漫长，且治疗成功率仅为50%。全球每年新发46.5万例利福平耐药结核病患者，其中耐多药结核病(MDR-TB)占78.0%，早期诊断耐多药结核病对于提高患者疗效并减少结核病在人际间的传播具有重要意义。我国是全球结核病高负担国家之一，估算耐多药结核病患者数位于全球第二，面对耐药结核病日益严峻的形势，及时并准确地对其做出诊断尤为重要。然而，传统的结核分枝杆菌检测技术由于周期长、敏感度低等原因已不能充分满足临床的实际需求，迫切需要新的检测技术。近些年随着全基因组测序的发展，结核分枝杆菌的遗传密码被不断解析，同时分子生物学以及细胞免疫学等多学科的交叉发展，促使结核分枝杆菌检测技术不断完善和进步[2]。检测新技术的完善除有效指导临床用药外，还可减少国家公共卫生经济负担，并提高耐多药结核病的治愈率，降低耐多药结核病的流行[3]。本文就传统检测技术及近些年新发展技术进行回顾，并分析其在耐多药结核病中应用的价值，以期为耐药结核病的诊断和治疗提供参考，并对医务工作者的临床实践有所裨补。

一、传统结核分枝杆菌耐药检测技术

(一)分枝杆菌分离培养法

分枝杆菌培养法是开展表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的前提和基础，依据分枝杆菌培养基的不同，主要分为固体培养和液体培养[4]。但若要获得较好的培养结果，接种前样本处理较为重要，据最新文献报道，OMNIgene·SPUTUM(OM-S)作为一种用于新鲜或冷冻痰液样本的液化和纯化的优化试剂，便于对痰液样本采集和运输，其结果表明，被OM-S处理过的痰液标本与传统的培养处理方法相比有更低的培养污染率，且在OM-S中保存、运输的样品与涂片镜检、罗氏培养(L-J)或液体培养(MGIT)相一致，并与新鲜的痰标本表现出相似性，同样可以作为更大规模可行性的研究[5]。由于固体培养需要时间较长，操作所需实验室安全等级的限制原因，其在早期发现结核病患者及耐药结核病的诊断方面有所欠缺[6]。

(二)药敏试验

表型药敏试验由于可检测出菌株对具体药物的敏感性和耐药性，在耐药结核病诊治方面具有巨大价值。主要包括固体药敏检测法、液体药敏检测法、7H10或7H11琼脂法，固体药敏检测又可分为绝对浓度和比例法，世界卫生组织推荐固体比例法和MGIT方法用于结核病耐药性检测。传统药物敏感性检测方法可对一线抗结核药物和二线抗结核药物做出准确判断，准确度高，价格便宜，但是由于结核分枝杆菌生长周期造成培养时间较长，限制了对耐药结核病诊断的时效性[7]。因此，应运而生的液体药物敏感性检测技术将大大缩短抗结核药物的诊断时间。目前，微量肉汤液体培养最低抑菌浓度法、MGIT液体法等更多地被实验室采用。有文献报道微量液体培养基最低抑菌浓度法检测速度快，有着较好的经济适用性，可为临床用药提供指导帮助[8]，但是近期的研究表明微量肉汤液体法由于接种菌量和培养方法等诸多不同，其判别药物耐药的关键浓度可能不能简单参考MGIT推荐的关键浓度，特别是对于低水平耐药的菌株可能造成耐药菌株的漏检，未来关于其关键浓度的不断优化将成为提高其检测敏感度的关键。目前，MGIT液体法药物敏感性检测技术可对多种抗结核药物进行检测，是世界卫生组织推荐的首选方法，特别在众多抗结核新药中，如贝达喹啉、利奈唑胺等抗结核药物中具有核心诊断价值[9]。但是，对于中低收入等耐药结核病高负担国家而言，液体药物敏感性检测技术因需专用设备等较高的成本，限制了其在基层实验室的广泛应用[10]。然而，不可否认，传统药敏检测技术均涉及大量活菌操作，其生物安全风险要求实验室人员全程在生物安全实验室中进行，对硬件的需求也是导致其无法在基层全面推广的重要因素。

二、结核分枝杆菌分子耐药检测技术

分子生物学技术通过对耐药相关的靶基因检测诊断结核分枝杆菌的耐药性，克服了传统表型方法依赖结核分枝杆菌生长的不足，最大程度满足了临床耐药诊断即时性的要求。根据技术原理的差异，分为实时荧光定量PCR、探针熔解曲线、线性探针等[11]。此外，随着基因组学技术的发展，基因组测序技术在检测耐药结核分枝杆菌中愈发突出。

(一)实时荧光定量PCR技术

利用PCR反应体系中荧光信号的积累实时监测来对未知模板进行定量分析。由于定量PCR检测技术具有速度快、精度高、风险小、不易污染等优点[12]，并可对结核分枝杆菌复合群及其耐药性进行监测，在耐药结核分枝杆菌检测中具有较高的价值。其衍生产品多种多样，主要包括利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(GeneXpert MTB/RIF)、TrueNat、MAX-MDR-TB等检测产品[9]。

GeneXpert MTB/RIF基本原理是依据半巢式实时荧光定量PCR，依托GeneXpert MTB/RIF平台自动化提取结核分枝杆菌DNA，并对rpoB基因进行扩增，来实现对结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测[13]。已有多项研究表明，GeneXpert MTB/RIF检测技术在快速筛查利福平耐药结核病方面具有较高的敏感度和特异度[14]。在结核分枝杆菌检测方面的敏感度和特异度分别为88%和99%[15]。此外，GeneXpert MTB/RIF检测技术在儿童肺结核诊断方面也表现出较好的性能，在痰培养阴性的儿童结核病中，其敏感度为2%[16]。而TrueNat MTB/RIF是由印度公司推出的快速检测结核病和利福平耐药性的新型分子检测方法，是一种基于芯片的核酸扩增实验检测技术，可在1h内检出结核分枝杆菌，在40～60 min内检出利福平耐药性[17]。其敏感度和特异度分别为91.1%和100%，在检测结核分枝杆菌上与GeneXpert MTB/RIF符合率高达92.7%[18-19]。BD 公司MAX-MDR-TB检测技术则是基于实时定量PCR技术对目标检测物进行裂解、DNA提取及其后续检测的自动化分析平台，可同时对结核分枝杆菌复合群中异烟肼、利福平耐药性进行分析，在耐多药结核病检测中对痰标本的敏感度要高于肺外标本(92%和52%)[20]。与培养相比，MAX-MDR-TB检测技术的敏感度可达86.6%,特异度可达100.0%，与MTBDRplus基因型相比，对利福平和异烟肼的敏感度和特异度分别为100.0%、99.4%；100.0%、99.4%。因此，该检测技术以其高通量、操作简单等优势在中大型耐药结核病诊断中心更具有价值[21]。

(二)线性探针技术

主要原理是基于对靶序列不同区域设计特异性探针，利用已知序列探针检测标本结核分枝杆菌对应基因区域是否发生突变。线性探针检测技术(line probe assay，LiPA)由于可检测rpoB、katG、inhA等耐药突变基因，因此线性探针检测技术以其高敏感度、高特异度、快速准确等特点，在耐药结核病的早期发现和诊疗中更有意义[22]。有文献报道，线性探针技术对异烟肼耐药菌株的敏感度为88.5%，特异度为100.0%，对利福平耐药菌株的敏感度和特异度分别为100.0%和99.3%。结果表明该检测技术显示出良好的一致性(≥91%)和准确性(≥99%)。因此，在耐多药结核病环境中显示出较好的诊断价值[23]。

(三)探针熔解曲线技术

通过分析特异性的探针与基因扩增产物的解链温度来判断待检测基因是否发生基因突变的方法称为探针熔解曲线技术。GeneXpert MTB/RIF Ultra作为GeneXpert MTB/RIF检测技术的改良版，利用熔解曲线技术替代一代的实时荧光定量PCR技术，其在结核性脑膜炎诊断中的敏感度要高于GeneXpert MTB/RIF[24]。并可替代传统药物敏感性检测方法，作为利福平耐药结核病患者的首选检测技术。GeneXpert MTB/RIF Ultra检测技术对结核分枝杆菌检测的敏感度要高于GeneXpert MTB/RIF检测技术(88.0%和83.0%)，而特异度要稍差于GeneXpert MTB/RIF(98% 和 96%)，且在利福平耐药性检测方面，两种检测技术敏感度和特异度是相似的，分别为95.0%、95.0%；98.0%、98.0%。可见，其在耐多药结核病检测中可提供更为精确的结果，适于耐药结核病的早期诊治[25]。我国厦门致善生物科技股份有限公司的MeltPro-TB检测技术主要是一种依据熔解曲线分析的实时PCR检测方法。其对利福平、异烟肼等一线抗结核药物及二线注射类和氟喹诺酮类抗结核药物耐药性检测都有较好的效能，对利福平耐药性检测的敏感度和特异度分别为98.7%和94.2%，而对耐多药结核病检测的敏感度和广泛耐药结核病检测的敏感度分别为86.7%和71.4%[26-27]。

(四)基因组测序技术

基因组测序技术通过对病原体基因序列测定分析，再与标准序列对比，以此实现对结核分枝杆菌耐药性的精准分析。其中以全基因组测序为代表的技术，以其高通量、高敏感度、高分辨率等优势在耐多药结核病和广泛耐药结核病的诊断中更具有前景价值。菌株在宿主内进化是结核分枝杆菌耐药产生的主要原因之一。有研究表明，通过全基因组测序技术可发现在潜伏期间结核分枝杆菌能够获得遗传突变[28]。因为目前所知的耐药突变位点不能很好地解释所有的耐药表型，全基因组测序技术则可以提供更为全面的耐药信息[29]。在一项通过全基因组测序技术预测结核分枝杆菌耐药谱的研究中发现，全基因组测序技术总的敏感度和特异度分别为86.8%和94.5%，尽管有局限性，但具有判断耐药谱的潜力，且具有耗时短的优点[30]。因此，全基因组测序技术因在结核分枝杆菌迅速诊断及药物敏感性预测上更具优势，这将会为我们提供对耐药结核病新的认识和理解[31]。但是全基因组测序技术成本高、数据分析复杂，因此限制了其在结核病高负担低收入国家的使用价值。相信随着科学技术的进步，全基因组测序技术会适用于耐药结核病的检测和研究。

三、传统药敏和分子药敏在临床应用中的困惑

新技术的应用能够帮助临床及时为患者制定适宜的治疗方案，但是多种药物敏感性检测方法在临床使用过程中也会出现问题，造成临床的困惑。首先，传统药敏试验虽然成为我国大多数医院常用的一种诊断方法，但是由于其周期长、敏感度低、对实验室要求较高、不利于在基层实验室开展、不能对结核病做出早期及时的诊断，使得耐药结核病迁延不愈[32-33]。此外，临床中大量使用分子技术诊断利福平耐药性，出现部分患者表型药敏试验敏感但是分子药敏耐药的情况，尽管造成上述不一致的原因很多，但是对于利福平而言，主要是由于部分rpoB基因突变引起低水平耐药，造成表型药敏的漏检，在世界卫生组织指南中认为rpoB突变出现可视为利福平耐药[34]；其次，对于异烟肼和二线抗结核药物，由于对其相关耐药机制解析不够，造成现有诊断技术敏感度无法与利福平相媲美，传统药物敏感性检测将作为分子耐药诊断的重要补充部分，提高耐药患者的发现率。最后，由于表型药物敏感性检测技术仍是依据现有资源而非耐药率进行应用的，而分子基因型检测技术虽然可以快速发现明显的耐药机制，但是在假耐药(突变不引起耐药)以及假敏感(不同于一般机制的突变)方面仍具有挑战性。因此，将分子基因型检测技术与表型检测技术相结合更有相得益彰之效，在耐药检测方面可获得更高的敏感度和特异度，以此准确预测耐多药及广泛耐药结核病的治愈情况[35]。

四、展望

尽管传统药敏试验结果仍然是耐药结核病诊断的金标准，但是由于其报告周期较长，生物安全等因素限制了其临床应用。近年来广为应用的分子生物学检测技术弥补了传统技术的不足，特别是针对利福平、异烟肼和氟喹诺酮类药物的检测方法最大程度提高了耐药患者的诊断效率，但是由于成本相对而言较高，制定适宜于高负担国家和地区的筛查策略将成为未来的研究重点。最近，世界卫生组织修订了广泛耐药结核病的定义[36]，如何扩充现有分子生物学对贝达喹啉、利奈唑胺等抗结核新药的药物敏感性检测能力，开发适宜在结核病高负担国家推广的技术迫在眉睫。此外，随着新材料、新方法在诊断领域的应用，纳米技术、生物传感器等高效能材料的使用势必提高现有诊断技术的检测能力，多维度探索研发新的检测平台以惠及耐药结核病患者，实现早诊断、早治疗的精准防控策略，为早日实现终止结核病的目标不断努力。