隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究进展

王成伟， 咸建春

(南通大学第五附属医院肝病科， 江苏 泰州 225300)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大的公共卫生问题，全球大约有20亿人感染过HBV，其中约有2.57亿慢性HBV感染者[1]。最新版欧洲指南将慢性HBV感染的自然史划分为5个期，即：①HBeAg阳性慢性HBV感染、②HBeAg阳性CHB、③HBeAg阴性性慢性HBV感染、④HBeAg阴性CHB、⑤HBsAg阴性期，其中第5期也被称作：隐匿性HBV感染(occult HBV infection，OBI )。上个世纪70年代末，在HBsAg阴性、抗-HBc阳性的供血者中发现其具有传播HBV的风险，并由此提出了OBI。数十年来，随着科学技术的发展，我们对OBI的认识也日趋完善。本文就OBI的定义、分型、起源、流行病学、发病机制、临床意义、诊断进行综述。

1 OBI的定义及分型

1.1OBI定义的基本构架：血清中HBsAg阴性、HBV DNA阳性或阴性，肝组织中的HBV DNA阳性。但各文章对OBI的定义有着细微而重要的区别，主要在于：①and/or、with/without的关系(肝组织中HBV DNA阳性伴/不伴(和/或)血清中HBV DNA阳性)，②血清及肝组织中的HBV DNA的具体水平，即：是否对HBV DNA水平进行定量描述，③肝组织中的DNA具体是哪种DNA，即：是否对肝组织中的HBV DNA进行定性描述[1～3]。2018年意大利举办的“关于OBI的陶尔米纳专家共识会议”将OBI定义为：根据现有的检测方法，血清乙肝表面抗原(HBsAg)检测呈阴性，肝组织中可以检测到具有复制能力的HBV DNA(即cccDNA)和/或血清中HBV DNA阳性，这种状态被称为OBI[2]。在OBI群体中，由于宿主免疫及表观遗传调控，肝组织中的cccDNA处于低复制状态。因此，当血清中HBV DNA被检测到时，往往处于低载量(<200IU/mL)，并且只能被间歇检测到[2]。

1.2OBI的分型：根据血清学检测结果，OBI可以分为血清学阳性及血清学阴性两类。其中，血清学阳性的OBI(Seropositive OBI)占比80%，其血清学特征表现为：抗-HBs(hepatitis B surface antibody，抗-HBs)和/或抗-HBc(hepatitis B core antibody，抗-HBs)阳性；血清学阴性的OBI(Seronegative OBI)占比1～20%,其血清学特征表现为：抗-HBs及抗-HBc阴性，其中，感染初期即表现为血清学阴性的OBI(primary OBI)即原发性OBI已在土拨鼠动物模型中得到证实[2]。

2 OBI的起源

OBI主要起源于获得HBsAg清除的CHB群体，其次为急性自限性乙型肝炎(Self-limiting acute hepatitis B)群体，上述二者往往表现为血清阳性的OBI，但是随着时间进展，也可转化为血清学阴性的OBI[2]。除原发性OBI外，还有一种特殊类型的OBI为婴儿免疫阻断后OBI，具体表现为：一些HBsAg阳性的孕妇所生婴儿经过免疫阻断(单用疫苗或联合乙肝免疫球蛋白)后，虽然血清中HBsAg阴性、抗-HBsAg阳性(提示免疫阻断成功)，但血清中可以检测到HBV DNA，提示这些婴儿免疫阻断成功后仍可能存在OBI[2]。由于对免疫功能的消耗存在差异，上述4个来源不同的OBI的传染性及相关并发症(如肝硬化、HCC、HBV再激活)的风险也不同，其中获得HBsAg清除的CHB群体的传染性及相关并发症的风险比急性自限性乙型肝炎及婴儿免疫阻断后OBI群体要高[2]。

3 OBI的流行率

目前对于OBI流行病学的调查仍然比较棘手，主要有下列几个原因：①检测方法的灵敏度及特异性；②HBV暴露的危险因素；③人群中的HBV流行率；④是否合并基础肝病及其严重度；⑤OBI的定义。由于上述原因的存在，无法对相关数据进行分析及对比。OBI在不同地区、不同人群中的流行率差异极大，可以低至<1%，也可以高至87%，但这需要谨慎解读，因为有上述多种因素可以影响OBI的流行率。目前，OBI的流行率主要是在供血人群及肝病人群中进行调查，但在供血人群中很少筛查出OBI，HBsAg阴性供血人群的HBV DNA检出率通常低于0.5%[2,4]。OBI的流行率与该区域及研究群体中显性HBV感染率相关，其中在亚洲地区有着较高的流行率[2,3]。OBI在慢性肝病患者中流行率较高，有研究表明：在HCV感染群体中达到15～33%，在隐源性肝硬化群体中达到32%，而在HCC患者中可能高达62%。OBI在有HBV感染危险因素的群体中的流行率表较高，详见表1[2](表1为参考文献中提及的数据)，对这部分群体需要进行定期筛查及监管[2]。由于方法学的限制，OBI在一般人群中流行率尚不明确。

表1 OBI在有HBV感染危险因素的群体中的流行率

4 OBI的发病机制

目前OBI的发病机制尚未完全阐明，大部分学者认为是多因素共同作用的结果。主要包括：病毒因素、宿主因素、其他因素。其中病毒因素包括：基因突变、病毒载量低、表观遗传调控、免疫复合物的形成；宿主因素包括：免疫及遗传因素；其他因素为：合并其他病毒感染[3,5]。

4.1病毒因素：①在OBI群体中，HBV基因组中4个开放阅读框(open reading frame)均可以发生突变，目前研究最广泛的是PreS/S突变。PreS/S突变可以通过：影响HBsAg的抗原性、免疫原性，引起HBsAg蛋白质构象发生改变，导致其不能被常用的商业试剂检测到，其中部分突变群体血清中的HBV水平与显性感染者相当，这部分群体被认为是“假OBI(False OBI)”；抑制HBV的复制及分泌，进而抑制HBsAg的表达及分泌，从而使得血清中HBsAg水平低于检测下限而导致其无法检出。但是，PreS/S突变的特异性并不高，有研究表明部分OBI群体中检测不到上述突变，同时部分显性HBV感染群体中可以检测到上述突变。②相比于HBV显性感染者，OBI群体血清中的HBV水平较低(<200IU/mL)。同时，也有研究表明OBI群体肝组织中的cccDNA水平也比HBV显性感染者低。因此，认为病毒载量低也与OBI相关。③表观遗传调控包括：HBV CpG岛发生甲基化，从而抑制HBV复制；通过乙酰化cccDNA上的H3/H4组蛋白可以调控HBV表达。④血清中抗-HBs与HBsAg形成免疫复合物，导致HBsAg检测不出。

4.2宿主因素：宿主免疫控制：①一系列长期持久的特异性T cell免疫可以抑制HBV复制。②OBI群体中，部分使用CD20单抗治疗的患者可以出现HBV再激活，因此认为体液免疫在OBI中也有重要作用[6]。③在土拨鼠模型中发现固有免疫在OBI中也有相应作用[7]。宿主遗传因素：①HLA(human leukocyte antigen，HLA)在免疫调节中发挥着重要作用，有研究表明HLA的多态性是决定HBV感染预后的重要因素。②宿主表观遗传修饰也可能与OBI有关。宿主细胞中的microRNAs可以调节某些宿主基因的表达，来影响HBV的复制和表达。

4.3合并其他病毒感染：合并HCV感染：①存在于同一肝细胞的HCV会抑制HBV的复制；②HCV核心蛋白通过与HBx蛋白之间相互作用抑制HBV DNA复制；③HCV非结构蛋白2(nonstructural protein 2，NS2)及5A(nonstructural protein 5A，NS5A)也会干扰HBV的复制[3,5]。合并HIV感染：有研究表明OBI合并HIV感染的群体通过HLA及其多态性，宿主表观遗传修饰来影响HBV的复制和表达[5]。

体外试验表明：从OBI群体中提取的HBV DNA在体外完全具体有复制能力，且能通过输血及器官移植传播。此外，在免疫功能低下的OBI群体中(如：接受肿瘤化疗或其他免疫抑制治疗)能观察到HBV再激活。上述证据支持：相比于病毒因素及其他因素，宿主免疫控制因素可能在OBI的形成中起到更加重要的作用[2]。

5 OBI的临床意义

OBI的潜在危害包括：传播(输血、器官移植、母婴传播)风险、引起和/或加重相关肝脏疾病以及HBV再激活的风险(再激活应DBI的相关治疗部分具体阐述)。

5.1传播风险：OBI是乙型肝炎传播链上不可忽视的传染源，患者可以通过输血、肝移植或者母婴传播的方式进行传播，使受者感染HBV[2,3]。在一些低收入国家(尚未实施NAT(nuclei acid testing，NAT)及抗-HBc检测)，OBI供血人群通过输血传播HBV仍然是一重要的卫生问题。即便在发达国家，也存在OBI供血者通过输血传播HBV的风险，因为导致HBV感染的最低病毒载量仍低于当前NAT的下限值[4]。有研究证实：即便在使用检测下限为5～20IU/mL的NAT进行HBV DNA筛查时，仍会遗漏部分OBI供血人群，并导致输血传播HBV[4]。尽管在供血人群中很少筛查出OBI，但是OBI供血者输血相关的HBV传播的发生率很可能被低估了，因为：①供血者的血清中不能或只能间歇检测到HBV DNA；②难以对受血者进行随访调查；③供血者的血清样本量有限；④输注OBI供者血液致HBV感染的受者往往无明显的急性肝炎的临床表现，容易被忽视及遗漏，这也可能代表了大多数的OBI供血者通过输血传播HBV的病例。值得庆幸的是，输血前受者体内存在抗-HBs可显著降低HBV感染风险。

即使在血清HBsAg清除后，HBV DNA仍可长期持续存在于HBV感染者的肝组织中。因此，OBI肝脏供者可将HBV传播给HBsAg阴性、抗-HBc阴性和抗-HBs阴性的受者，受者感染HBV后有进展为肝炎的风险，因此建议受者使用NUCs(ETV或TAF/TDF)进行长期的预防性抗病毒治疗。然而，尽管预防性抗病毒治疗能够防治肝炎的发生，却可能无法完全预防OBI的发生。

HBsAg阳性的母亲所生新生儿免疫阻断后，尽管部分婴幼儿在第18周时血清学检测结果提示母婴阻断成功(即婴儿HBsAg阴性且抗-HBs阳性)，但血清中仍可检测到HBV DNA，建议连续随访至少至24月龄，若HBV DNA持续阳性，可考虑发生OBI[8,9]。

5.2OBI与肝脏疾病：CHB群体在获得HBsAg清除后通常都能获得良好的预后，但仍有一部分人会发生HCC，尤其是HBsAg清除发生50岁以上的男性及已经形成肝硬化的群体[3]。据推测，对于HBsAg血清学清除的CHB患者，若存在OBI，其HCC发生的风险并未消除，但可能会降低。在一项研究中，2.34%(7/298)的HBsAg血清学清除患者在9年的中位随访中发生HCC，其发生率取决于性别和HBsAg血清学清除发生的年龄[2]。目前多数学者认为：OBI在肝硬化和HCC的进展中起着重要作用。例如，在多项涉及隐源性HCC患者的回顾性研究中，发现60%～70%的患者合并有OBI[2,10]。在日本的一项涉及82例隐源性肝硬化患者的前瞻性研究中，HCC 10年累积病发生率为：合并OBI组为100%，未合并OBI组为17.6%(p = 0.008)，多变量分析证实，在这项前瞻性研究中，OBI是隐源性肝硬化中HCC发生的独立危险因素[2]。多项前瞻性研究的结果显示：OBI合并HCV感染患者的HCC发生率是单纯HCV感染的2倍以上[2]。同时，对土拨鼠动物模型的研究证实：在土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)表面抗原清除后(起源自急性自限性感染)，肝组织中仍能持续检测到WHV DNA，肝组织病理学表现为：持续轻度的坏死性炎症，并且伴有较高的肝癌发生率[2]。

一系列证据表明：OBI保留了显性HBV感染的致癌机制，包括直接和间接机制，直接机制为：①HBV DNA整合到宿主基因上，②产生致癌蛋白；间接机制为：肝组织中形成长期持续轻度的坏死性炎症，促进肝组织往肝硬化的方向发展，进而再形成HCC[2,3]。OBI患者的HBV能整合到宿主的基因组中，使宿主基因组或者HBV自身发生改变，有着直接的致癌作用。HBV DNA整合到宿主基因上，形成插入突变，破坏染色体的稳定性，引起宿主基因功能改变，引起原癌基因表达上调或者抑癌基因表达下调，最终导致肿瘤的发生，也可以导致自身的功能发生变化，产生致癌蛋白：HBx、PreS/S,这些蛋白可能会扰乱宿主基因的表达调控机制或者激活致癌信号通路，从而导致肿瘤的发生[2,3,5,11]。

OBI是否会导致肝损害及加速基础肝病肝硬化的进展目前仍有很大争议[2]。有部分学者发现：起源自急性自限性乙型肝炎的OBI群体肝组织中存在着长期持续的轻微的坏死性炎症，这些群体往往无肝功能受损的临床及生化学表现，这与在土拨鼠模型中观察到的情况一致。同时也有研究表明：OBI群体血清中的HBV DNA载量具有波动性，HBV DNA可能被间歇检测到，当HBV DNA复制能力一过性增强时，往往伴随着丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase，ALT)水平的升高[2]。因为在OBI群体中对于HBV的抑制不是永恒持久的，随着时间的推移，会出现短暂的HBV再激活进而引起肝损害[2]；另一方面，少量病毒蛋白持续刺激诱导大量的特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)释放从而导致肝损害[2]。

6 OBI的诊断和相关治疗

OBI的诊断主要依赖于血清学及病毒学检查，其中检测方法的敏感性及特异性尤为重要，这将影响到OBI诊断准确率(防止误诊及漏诊)及对危险人群的筛查及监管。首先，OBI的定义要求血清中HBsAg阴性，目前多数商用HBsAg检测方法的检测下限是0.05 IU/mL。然而，有研究表明：使用上述方法检测出的阴性样本中，有1%～48%的样本在高灵敏的HBsAg检测方法(检测下限为0.005 IU/mL)中呈阳性[12,13]。通过上述高灵敏的检测方法，可以发现更多的HBV显性感染，防止误诊为OBI。除了灵敏度外，商用HBsAg测定方法在检测S-逃逸变异体(S-escape variants)的能力上也存在差异[14]。因此，所有HBsAg检测应强制使用针对HBsAg多个表位的抗-HBs探针，以确保检测到HBV S变异体，因为其中存在部分“假OBI(False OBI)”。

OBI的诊断是基于在HBsAg阴性个体血清中检测到HBV DNA或肝组织中检测到具有复制能力的HBV DNA，即cccDNA。结合OBI的定义，可以发现检测肝组织中的cccDNA是一个最直接的方式，但由于肝穿刺难以大规模推广以及目前国内外尚无标准化的检测方法[7]，因此，检测血清中的HBV DNA是一种更加常用的方法，包括：实时PCR(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)及巢式PCR(nested polymerase chain reaction，nested PCR)。其中，至少包括S、C和X三个以上基因片段的引物作PCR检测阳性才能诊断为OBI。整合的HBV DNA不能作为OBI诊断标准，因为其不具有复制能力。目前多数商用HBV DNA检测方法的检测下限是5～20 IU/mL，但有研究发现使用此下限值的NAT仍会漏诊部分OBI，且其具有输血传播HBV的风险[4]。因此，对于血液制品的检测，其核酸检测(nuclei acid testing，NAT)的特异性需达到99%(如：Procleix-Ultrio Elite assay )，下限值通常在2～4 IU/mL，这样才能有效阻断OBI群体输血传播HBV[4]。OBI群体血清中的HBV DNA通常处于低载量(<200IU/mL)，同时因其载量的波动性可能被间歇检测到，因此建议每次采集(血浆)量≥1mL，必要时可以多次取样，以防止漏诊OBI。

检测血清中的抗-HBc常作为一种替代标志物。抗-HBc阳性通常代表着既往HBV感染，由于血清学阳性的OBI占80%，因此，抗-HBc阳性可以指定一部分群体来进行核酸检测进而诊断或排除OBI，这有利于流行病学的研究及高危人群的初步筛查。同样地，血清学抗-HBc阴性也不能完全排除OBI。

当OBI群体接受肿瘤化疗或其他免疫抑制治疗时，他们可能会发生HBV再激活，但OBI群体HBV再激活发生率低于慢性HBV感染群体[2,3,15]。OBI群体在不同条件下的HBV再激活率差异较大，详见表2，可据此对OBI群体进行风险分层，并制定相应策略，详见表3。其中有一类特殊群体需单独阐述，即：OBI合并HIV(human immunodeficiency virus，HIV)感染，鉴于HIV和HBV有共同的传播途径，以及HIV破坏免疫系统，HBV再激活在OBI合并HIV感染的群体中也有大量报道。然而，伴随着强效的抗逆转录病毒药物的广泛使用，包括兼顾有抗HBV活性的抗逆转录病毒药物的广泛使用，在接受恰当治疗的艾滋病群体中(合并OBI)，HBV再激活的风险已经变得微不足道。但是，值得关注的是：当调整抗逆转录病毒治疗方案(如：停用抗HBV药物时)，合并HIV感染的OBI群体也可能会发生HBV再激活。

表2 OBI群体在不同条件下的HBV再激活率

表3 OBI群体HBV再激活风险分级及防治策略

7 小 结

OBI是一个普遍存在但容易被忽视的问题。过去数十年间，随着血清学及病毒学检测技术的发展，对OBI的认识日趋完善。然而仍有疑惑未得到解决：①尚无标准化检测方法，不同研究不能进行对比及组合；②需要高灵敏的检测方法来协助诊治；③不同地区不同人群的OBI流行率尚不明确；④OBI是否会、如何、在什么情况下导致和/或加重肝脏疾病尚不明确；⑤需进一步明确OBI的传播风险；⑥对于OBI群体的HBV再激活尚无通用的指南；⑦对于OBI的发生机制，仍需要进一步的研究。因此，对于OBI的研究依然任重而道远。