月经血结核杆菌FQ-PCR检测联合IGRA对女性生殖器结核诊断价值

陈红梅， 王 起， 方 喆， 黄移生， 蒋 源

(湖南省长沙市湖南省胸科医院/湖南省结核病防治所院内一科， 湖南 长沙 410006)

女性生殖器结核(FGT)是因结核杆菌感染所引起的女性生殖器疾病，该病常见于10～40岁女性，在绝经后老年妇女也可见[1]。FGT多因肺结核、肠结核等其他脏器结核血行散播所引起，其中输卵管结核占85%～90%，其次为子宫内膜结核、卵巢结核，该病主要以发热、盗汗、乏力、食欲不振、下腹坠痛为表现，缺乏特异性的临床表现[2]。FGT与输卵管性不孕、复发性流产等疾病具有较高的相关性，因此提高该病的诊断效率具有重要的意义[3]。目前对于该病的诊断除全身及妇科检查外常以子宫内膜病理检查、输卵管造影、活体组织检查等方式进行，但上述诊断方法均可对患者造成一定的损伤，对于输卵管和不明原因不孕及复发性流产患者早期结核杆菌筛查中适用性不高。月经血结核杆菌荧光定量PCR(FQ-PCR)检查取材过程无痛方便且被证实可用于FGT的诊断，但因取材等原因导致该诊断方法有一定的漏检率，因此本研究旨在通过分析月经血结核杆菌FQ-PCR检测联合γ-干扰素释放试验(IGRA)对FGT的诊断价值，以期为怀疑生殖器结核的输卵管性及不明原因不孕、复发性流产患者结核杆菌筛查提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择2016年7月至2019年9月在湖南省胸科医院(湖南省结核病防治所)就诊的输卵管性及不明原因不孕、复发性流产患者156例进行研究。纳入标准：①行宫、腹腔镜进行常规病因学检查；②在检查前未接受过抗结核治疗；③患者神志清醒，智力正常，愿意配合相关检查；④患者已获知情同意。排除标准：①合并免疫系统疾病者；②既往已确诊为FGT的疑似复发患者。③其他系统结核病患者。

1.2方法:对患者进行病因学检查、月经血结核杆菌FQ-PCR检测及IGRA检测。①月经血结核杆菌FQ-PCR检测：在月经来潮1～3d，以窥阴器扩开阴道后采用无菌注射器吸取月经血1～2mL进行FQ-PCR检测，具体操作如下：1mL月经血中加入10mL NH4Cl，涡旋混匀后静置30min，以2500r/min转速离心10min后取沉淀置-20℃冰箱保存备用。取40μL沉淀加入40μLDNA提取液，吹打混匀后置100℃水浴10min进行DNA提取，水浴取出后室温静置1h，以13000r/min转速离心10min，取上清液10μL加入反应体系，按FQ-PCR试剂盒进行常规操作，≥50Copy则认为是阳性。DNA提取试剂盒购于德国默克公司，FQ-PCR试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司，采用美国伯乐公司生产的CFX96型FQ-PCR仪进行检测。②IGRA：抽取患者空腹外周静脉血4mL肝素抗凝后分离外周血单个核细胞，在微孔板阴性对照孔中加入50μL的细胞培养液，阳性对照孔则加入50μL植物血凝素，2个测试孔分别加以50μL的结核杆菌早期分泌抗原靶6ku蛋白(Early Seeretary Antigenic Target 6ku Protein，ESAT6)抗原(A抗原)及培养滤液蛋白10( Culture Filtrate Protein 10,CFP10)(B抗原)。在上述孔中分别加入稀释后的外周血单个核细胞溶液100μL，按英国OxordImmunotec公司生产的试剂盒说明书进行孵育、洗涤、显示等操作。结果判断标准：当空白对照孔斑点数为0～5且A抗原或B抗原孔斑点数-孔板对照孔斑点数≥6；空白对照孔斑点数6～10个且A抗原或B抗原孔斑点数≥2倍孔板对照孔版点数则认为有反应性。若与上述情况不符且阳性质控对照孔正常则认为是无反应性。③金标准：常规术前检查无异常者在月经干净后3～7d住院，以腹腔镜下对患者子宫、卵巢、输卵管、盆腔情况进行检查，对盆腔腹膜或脏器表面出现粟粒氧结节、干酪样改变、盆腔广泛黏连钙化、输卵管增粗僵硬等疑似病灶进行活检送病理检查，以镜下表现及病理结果结合可确诊为盆腔结核。内膜结核者宫腔镜下可见内膜不均匀灰白色或干酪状增生，血管丰富迂曲，严重者可见内膜瘢痕化，宫腔黏连，将异常组织送病理检查，见有典型结核结节即可诊断为内膜结核。根据金标准诊断结果阳性者为病例组，阴性者为对照组。分析月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测联合IGRA单独检测与联合检测对盆腔结核及内膜结核的漏诊率。漏诊标准：病理检查确诊者未被检出即为漏诊，联合检测指2种检测方式均未检出病理检查确诊者即为漏诊。

2 结 果

2.1一般情况:156例患者输卵管性及不明原因不孕者共92例，经腹腔镜临床及病理确诊为生殖器结核21例(病例组)，对照组包括子宫内膜异位5例，盆腔黏连49例，正常盆腔17例。复杂性流产患者64例，宫腔镜临床及病理确诊为生殖器结核17例(病例组)，观察组包括：慢性子宫内膜炎36例，正常内膜11例。两组一般情况差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

表1 不同组输卵管性及不明原因不孕者一般情况比较

表2 不同组复杂性流产患者一般情况比较

2.2不同诊断方法对盆腔结核漏诊率比较:联合检测对盆腔结核漏诊率为14.29%，低于月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测单独检测的42.86%与IGRA的52.38%(P<0.05)，见表3。

表3 不同诊断方法对盆腔结核漏诊率比较(n=21)

2.3不同诊断方法对内膜结核漏诊率比较:联合检测对盆腔结核漏诊率为11.76%，低于月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测单独检测的35.29%与IGRA的52.94%(P<0.05)，见表4。

表4 月经血结核杆菌FQ-PCR检测对FGT诊断效能分析(n=17)

3 讨 论

近年随着耐多药结核杆菌及艾滋病的流行、抗生素及免疫抑制剂等药物的滥用、器官移植增加等原因导致结核分枝杆菌感染性疾病的发生率明显升高的趋势[4]。结核分枝杆菌感染机体后，若得不到及时、有效的治疗可致结核分枝杆菌在体内大量繁殖并破坏入侵白细胞而引发结核病，除毛发、牙齿及指甲外，机体所有的组织器官均可受结核分枝杆菌的感染。临床上以肺结核最为常见，肺外结核多结核分枝杆菌呼吸系统感染后经肺部病变由血液或淋巴系统播散至全省各脏器，调查数据显示全球每年结核新发病例超过800万，每年有140多万人因结核病而死亡，FGT近年来发病率也有明显上升的趋势，约占肺外结核的11.9%[5]。FGT目前仍是发展中国家女性不孕及复发性流产的重要病因，结核杆菌感染生殖器官后可形成慢性炎症，输卵管为最早感染部位，其次为内膜组织，因感染初期症状隐匿，常引起漏诊与误诊，但随着该病的疾病进展可经腹腔镜及宫腔镜发现不可逆性的病变，对患者的生殖功能造成严重的影响[6]。因此FGT的早诊断、早治疗对于保护患者的生育功能具有重要的意义。

FGT诊断金标准目前仍以病理学为主，病理学检查在获取组织样本过程可对患者造成一定损伤，同时在疾病早期患者病变不明显难以准确获得组织样本，因此目前尚无一种可完全诊断生殖器结核的方法，多需要结合患者病史、临床表现并采用多种检测手段以综合诊断[7]。因此对于输卵管性及不明原因不孕、复发性流产患者中可开展生殖器结核高危患者初步筛查、病原学检查及手术病理学诊断的阶梯式诊断流程。目前临床上对于病史、基础体温、子宫输卵管造影结果提示FGT高危的患者进行病原学检查，但传统的培养、涂片镜检等病原学检查方法检测周期长，技术条件高，目前应用已较少。近年来随着分子生物学技术的发展，PCR技术可通过快速扩增DNA而实现多种感染性疾病的快速诊断，尤其是FQ-PCR技术采用荧光标记探针的方法实现了定量功能且操作过程自动化程度较普通PCR更高，在减少劳动力的同时还可提高检测的准确率，同时还可避免操作人员在使用传统PCR电泳时接触有毒有害试剂而保护操作人员的健康。国内关于月经血结核杆菌FQ-PCR检测用于诊断女性生殖器结核的研究已有相关报道[8]，该研究认为月经血为子宫内膜周期性脱落及子宫内膜层血管所出的血，可有效反映子宫内膜、输卵管等女性生殖器官的生理及病理状态，获取月经血这一特殊样本过程方便无痛，相对于诊断性刮宫、腹腔镜、宫腔镜等有创诊断患者接受程度更高。有研究者曾对不孕症患者取月经血、子宫内膜组织进行培养、抗酸染色及组织学检查，结果显示在结核杆菌培养阳性标本中月经血占约70%，该研究认为月经血结核杆菌培养阳性率高且无创，目前月经血培养已成为FGT诊断的金标准之一，但该检测方法对操作者经验要求较高，同时需要至少8周的时间进行检查，不利于患者的早期诊断[9]。使用PCR诊断虽可缩短检测时间，但漏诊率较高，本研究结果显示：本研究结果显示：月经血结核杆菌FQ-PCR检测对盆腔结核漏诊率为42.86%，内膜结核漏诊率35.29%。可能与月经血标本为血性标本，其中的血红蛋白可抑制Taq酶活性，虽然在前处理过程已进行去除血红蛋白的操作，但仍可引起一定的漏检。再者月经血中结核杆菌含量较低，月经血取样过程中为整体取样，无法对疑似病灶进行特殊取样使得其代表性受限，采取多次、多量取样可能可提高诊断效能[10]。

IGRA主要利用ESAT-6抗原及CFP-10抗原刺激受试者外周血单个核细胞，再利用酶联免疫斑点法对IFN-γ分泌细胞进行计数而诊断结核，该方法在2008年被美国FDA批准用于结核病的辅助诊断，近年来该方法被用于多种肺外结核患者的辅助诊断取得满意的效果[11]，本研究结果显示：联合检测对盆腔结核漏诊率为14.29%，低于月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测单独检测的42.86%与IGRA的52.38%(P<0.05)且联合检测对盆腔结核漏诊率为11.76%，低于月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测单独检测的35.29%与IGRA的52.94%(P<0.05)。IGRA检测过程中不受卡介苗及其他肺结核分枝杆菌的影响，另外对于免疫低下或免疫抑制人群的患者结核杆菌感染T细胞检测同样适用，但该诊断方法无法同时预测结核病的发生、发展情况，同时该诊断方法无法确定结核杆菌感染部位，仍需结合其他相关检查[12]。联合诊断可弥补不同检测方法的缺陷而提高临床的确诊率，但因IGRA对实验室要求较高，检测费用也相应升高，联合诊断使患者的经济负担明显增加，临床实践过程中可根据患者意愿先采用月经血FQ-PCR检测，对于检查阴性但结合临床症状等其他手段分析疑似的患者可进行γ干扰素释放试验以提高诊断率，发挥不同诊断的优势而达到优势互补，使患者最大程度获益[13]。

综上所述，月经血结核杆菌FQ-PCR检测及IGRA作为输卵管性及不明原因不孕、复发性流产患者FGT早期筛查手段均存在一定的漏检率，两种诊断方式联合检测可有效降低漏检率。虽然联合诊断的方法可降低漏诊率，但需要注意的是若出现月经血结核杆菌FQ-PCR检测阴性但IGRA阳性时需结合病理等其他诊断方式才可进行最终确诊。另外本研究为单中心研究，样本量较少，指标有限，取得的结果可能出现一定的偏差，下一步将考虑进行多中心增加样本量的研究以进一步证实本研究的观点。