限制型心肌病患儿致病基因检测1 例报告

扬 翼 谢利剑 肖婷婷 侯翠兰

上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院心内科（上海 200062）

限制型心肌病（restrictive cardiomypathy，RCM）是一种罕见的非缺血性心脏病，是以心室心内膜纤维化、心室舒张功能障碍为特征的一类心肌病[1]，临床少见，约占心肌病的5%，但预后差，心源性猝死风险高，特别是儿童生后2 年、5 年病死率分别约为50%、70%，心脏移植通常成为最终的治疗手段[2]。原发性RCM 30%为家族性，提示遗传因素的重要性[3]。RCM的遗传方式以常染色体显性遗传为主，但也可表现为常染色体隐形遗传。研究表明，基因变异是RCM 发生、发展的重要原因之一。目前已在心肌肌钙蛋白Ⅰ基因（cardiac troponin Ⅰ，TNNI3）、心肌肌钙蛋白T基因（cardiactroponin T，TNNT 2）、心肌肌钙蛋白C 基因（cardiac troponin C，TNNC 1）、α-心脏肌动蛋白基因（α-cardiac actin，ACTC1）、β-肌球蛋白重链基因（β-myosin heavy chain 7，MYH7）、肌球蛋白调节轻链基因（myosin regulatory light chain 2，MYL2）、肌球蛋白必需轻链基因（myosin regulatory light chain，MYL 3）、α-原肌球蛋白基因（α-tropomyosin 1，TPM 1）、心肌肌球蛋白结合蛋白C（myosin-binding protein C，MYBPC3）、结蛋白基因（desmin，DES）等基因中找到与RCM相关的变异基因[4]。其中以TNNI3、TNNT2、MYH7、ACTC基因变异为主，提示肌节蛋白变异是原发性RCM 的重要遗传基础[3]。因此对肌节蛋白相关基因进行筛查对原发性RCM发病机制的研究有重要意义。本文主要介绍TNNI3基因。

TNNI3位于染色体19q13.4上，由8个外显子组成，编码心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）在心肌中表达。细胞内Ca2+水平的主要传感器是肌钙蛋白复合物，肌钙蛋白复合体是心肌收缩、舒张活动中最重要的功能成分，由肌钙蛋白T 与肌钙蛋白c、肌钙蛋白Ⅰ亚基组成[3]，其主要功能是控制肌肉收缩和松弛过程中粗细纤维间的相互作用。而cTnⅠ具有抑制作用，可以抑制肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用，抑制心肌细胞收缩[5-6]。在Ca2+结合后，肌钙蛋白C可通过钙离子对肌肉收缩的调节逆转这种抑制作用，因此肌钙蛋白复合物的构象发生变化，导致肌肉收缩[7]。

本研究利用全外显子测序（whole exome sequencing，WES）检测1 例儿童可疑R CM 的致病基因，评估WES 对RCM 遗传检测的可行性，并分析该基因变异与RCM表型的相关性。

1 临床资料

患儿，女性，4 岁8 个月，因咳嗽、发热7 天，发现心律失常2 天就诊。患儿系G1 P1，足月，剖宫产，出生体质量3 600 g。患儿生长发育无异常；否认家族遗传性或先天性病史。患儿于2019 年2 月（4 岁6 个月）上楼时有口唇发绀1次（具体情况不详）。患儿入院前彩色超声心动图示：①全心扩大，运动减弱；②心功能不全；③少量心包积液；④二尖瓣关闭不全（中量反流）；⑤肺动脉高压。入院前心电图示窦性心动过缓，双心房负荷重，左心室高电压，广泛导联ST 段改变，广泛导联T波改变，Q-T间期延长。入院体格检查：神清，呼吸平稳，反应可。全身未及明显皮疹，浅表淋巴结未及肿大，咽稍红，双扁桃体无明显肿大；双肺呼吸音粗，可闻及痰鸣音；心音稍弱，心率78次/min，律齐，未及病理性杂音；腹软，肝脾肋下未及；四肢肌张力可；神经系统检查无异常。入院后实验室检查：血常规白细胞总数8.40×109/L，血红蛋白119 g/L，血小板总数187×109/L，中性细胞百分比59.3%，淋巴细胞百分比35.5%，中性细胞绝对值4.98×109/L，淋巴细胞绝对值2.98×109/L，C反应蛋白28 mg/L；肌红蛋白8.66 ng/mL，N末端脑钠肽 1 423.86 pg/mL，肌钙蛋白Ⅰ 0.02 ng/mL。心型脂肪酸结合蛋白0.6 ng/mL，肌酸激酶-MB同工酶 2 U/L，肌酸激酶 26 U/L，乳酸脱氢酶 235 U/L，肝肾功能、电解质无异常。患儿入院诊断：心肌病（限制型心肌病可能，扩张型心肌病可能）、心功能不全Ⅱ级、肺炎。

患儿入院后完善心电图、超声心动图及冠脉CT等检查。入院第1 天，心电图示窦性心律，心房肥大，左室肥大，ST改变（各导联ST压低1.1～2.3 mm），T波改变（各导联T 波低钝、倒置）；超声心动图示双房显著增大，左右室心肌疏松（右室为主），二尖瓣中重度反流，三尖瓣中度反流左心收缩功能减低（射血分数为56%）。入院第2 天，患儿心脏冠脉CT 血管造影（cardiac coronary CT angiography）检查示冠状窦增粗，余冠脉未见明显异常；左心室、左心房及右心房增大，心包少量积液。入院第4天，复查心电图示窦性心律，左室肥大，ST改变（Ⅱ、Ⅲ、aVF、V5、V6导联ST压低1～2 mm），T波改变（各导联T波均低钝、倒置）；复查超声心动图示心脏位置及连接正常，左房及右房显著增大，左室内径增大，左右室游离壁及右室心尖部心肌疏松，肌小梁呈海绵样增厚（右室为主），肺动脉总干血流0.6 m/s，二尖瓣瓣环内径2.8 cm，血流0.8 m/s，反流中重度；三尖瓣瓣环内径2.3 cm，血流0.6 m/s，反流中度，反流压差32 mmHg，沿房间隔未见明显穿隔血流，室间隔连续；左位主动脉弓，左右冠状动脉开口未见增宽，未见明显动脉导管开放，组织多普勒超声检测左右房室瓣环舒张早期充盈峰（E）与舒张晚期充盈峰（A）的比值（E/A）均＜1；动态心电图示窦性心律+异位（平均心率56次/min，最快心率100次/min，最慢心率41次/min），室性期前收缩76个，交界性异博28个。

入院后，患儿予地高辛强心，氢氯噻嗪、螺内酯利尿，磷酸肌酸钠营养心肌，同时予卡托普利降压，头孢曲松抗感染。经治疗，患儿无咳嗽、气促、面色青紫等不适，予出院并随访。

因根据患儿心电图、超声心动图及冠脉CT 等检查，结合临床表现，考虑心肌病可能，不能排除基因异常导致，故予完善全外显子测序行基因检测。经上海市儿童医院伦理委员会批准，并获得患儿或父母签署知情同意书，采集患儿及其父母的外周血2 mL，使用吸附法DNA 提取试剂盒（QⅠAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen公司，Hilden，Germany）提取基因组DNA，通过琼脂糖电泳对样本DNA 进行质测分析合格，使用Roche Nimblegen Seq Cap EZ Exome V3（罗氏）试剂盒对检测样本的外显子编码区及其上下游20 bp 区域进行捕获、扩增、建库，采用高通量测序平台（Hiseq2500）测序。在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）网站下载TNNI 3基因DNA 全序列（NM_000363.4，Gene ⅠD：7137），采用Primer 5软件设计聚合酶链式反应引物，由上海生工生物工程有限公司合成；利用PCR 试剂盒（天根生化科技有限公司）扩增。引物序列为，F：5’-ACT TAG GCA TCC AGG GTA GA-3’，R：5’-GCC CTG GGT AAT AGA CAT GGA-3’。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，经过30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR 产物纯化、利用 ABⅠ 3730 XL 全自动DNA 测序仪，采用正向测序，与标准序列对比分析基因序列，以进一步验证变异基因。在HGVS 标准基础上与参考基因组NCBⅠ Genome（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）比对，并综合人群频率数据库ExAC（http://exac.broadinstitute.org/）、千人基因组1000 Genomes Project、致病性数据库ClinVar（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）、OMⅠM（http://www.omim.org）等进行注释。通过NCBⅠ Homologene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）对变异位点在不同物种间进行氨基酸序列同源性比对。使用 SⅠFT、Polyphen2、Mutation Taster、Mutation Assessor等软件对候选基因的致病性进行预测，评估变异致病性。

图1 患儿家系的 Sanger 测序图

图2 变异位点在不同物种氨基酸同源序列比对结果

通过WES 筛查，本例患儿携带TNNI 3（NM_000363.4）杂合变异。Sanger 测序证实，患儿父亲和母亲均无该变异（图1）。该变异导致精氨酸变异为组氨酸。通过NCBⅠ Homologene 对TNNI 3基因192位点氨基酸的对比，发现该位点在不同物种之间有高度保守性（图2）。根据OMⅠM 数据库、ClinVar 数据库和临床表型分析，认为该基因变异与患儿的临床表型有关联。患儿携带的TNNI 3基因c.575 G＞A（p.Arg192His）变异在GnomAD数据库、千人基因组数据库均无人群频率报道，ClinVar数据库显示既往有该变异位点报道，临床意义为致病（pathogenic）。通过PolyPhen2、SⅠFT、Mutation Taster、Mutation Assessor软件进行TNNI3基因c.575G＞A（p.Arg192His）变异的有害性预测。PolyPhen2预测变异评分为0.994，变异类型为很可能有害（probably damaging），多重串行比对也显示TNNⅠ3 蛋白第192 位精氨酸残基高度保守，说明该位点对正常蛋白功能的表达非常重要（图3）。SⅠFT软件预测评分为-4.636，预测变异类型为有害的（deleterious）。Mutation Taster 软件预测为Model：simple aae,prob:0.999100999547085，属于致病（disease causing）。Mutation Assessor软件预测致病性为中等（medium）。

图3 PolyPhen2 软件中的多重串行对比（黑框为变异位点）

2 讨论

通过WES发现本例患儿携带TNNI3基因c.575G＞A（p.Arg192His）杂合变异，为新发变异。该变异导致TNNI 3基因第192 位的精氨酸（Arg）被组氨酸（His）取代。通过氨基酸同源性序列比对发现，TNNI 3基因的第192 位氨基酸残基在不同物种间存在高度保守性。查询ExAC数据库、OMⅠM数据库、千人基因组数据库显示均无人群频率报道，说明该变异相对罕见。ClinVar数据库显示既往有该位点变异报道，变异意义为致病。经过PolyPhen2、SⅠFT、Mutation Taster等软件预测显示该位点变异很可能有害，说明c.575G＞A变异很可能会影响TNNI3基因表达和蛋白质功能。本例患儿的心电图及超声心动图均提示双侧心房增大，BNP异常增高，符合RCM的诊断。

RCM 是由编码肌小节蛋白的基因变异导致的遗传病，其中TNNI 3基因是主要的致病基因之一。TNNI3基因的相关变异会增加心肌细胞对钙离子的敏感性、ATP 酶活性及心肌收缩力水平[4]，从而导致疾病发生。其中与本例患儿相关的TNNI3基因c.575G＞A（p.Arg192His）变异定位在蛋白质的保守C端区域内，位于肌动蛋白与肌钙蛋白Ⅰ结合区域，其机制可能是通过改变Ca2+亲和力，引起心肌纤维对 Ca2+的敏感性增加，造成心肌收缩力增强和纤维舒张功能障碍，最终导致心肌病的发生[8-9]。除此之外，Arg192His转基因小鼠同样呈RCM 表型[10]，也证明了该位点突变与RCM相关。

2003 年报道第1 例TNNI 3基因Arg 192 His 变异病例[7]，为RCM伴阵发性房颤男性患儿，16岁时心超提示双房重度增大，左室壁厚度正常，收缩功能正常；心电图显示所有导联p波异常；19岁时死于心脏衰竭；期间取右心室内膜心肌活检显示非特异性间质纤维化，无心肌细胞肥大或心肌细胞紊乱；基因测序发现TNNI3第8外显子存在第92位上胞嘧啶核苷酸被腺嘌呤核苷酸替换，导致Arg192His氨基酸替换；这种变异在患儿父母中都不存在。另1例TNNI3Arg192His变异导致左心室心肌致密不全病例为女性患儿，13岁时学校体检发现心电图异常，后出现呼吸困难与晕厥等；期间超声心动图及心肌内膜活检均提示左心室心肌致密不全；基因检测提示TNNI 3杂合错义变异575G＞A（p.Arg192His）；15岁时因室颤导致心脏性猝死[8]。还曾在一家系中发现TNNI36467G＞A（p.Arg192His）变异，先证者7岁起就有心力衰竭，并伴有渐进性疲劳和呼吸困难；超声心动图显示双房增大，左室肥厚不对称，最大左室壁厚17 mm，左室收缩功能正常，充盈受限；心导管检查显示肺动脉压无异常；先证者16岁时心脏性猝死；先证者父亲29岁时患充血性心力衰竭，后期诊断为RCM，47岁时死于多器官功能障碍；先证者姐姐10岁时开始出现心力衰竭，4次晕厥发作，最终也被诊断为RCM，且于16岁时心脏性猝死[11]。

由TNNI3的575G＞A（p.Arg192His）基因变异导致的心肌致密化不全，RCM等各种不同心脏病，最终导致心力衰竭，预后差，猝死率高，需要起搏器植入或心脏移植治疗。TNNI3Arg192His变异可为家族性遗传，但本例患儿为散发性变异，父母均无该变异，且年龄仅有4岁8月龄，早于既往报道病例。本例患儿经过对症治疗后好转出院，但仍需门诊随访评估心脏损害程 度。

综上，RCM的临床诊断为排他性诊断，需除外肥厚型心肌病、瓣膜性心脏病、心包疾病和先天性心脏病等。由于RCM 患儿临床症状及辅助检查结果常不典型，故全外显子测序可为RCM 遗传学诊断及基因治疗提供方向。