miR-186-5p靶向TrkB-T1抑制食管癌细胞迁移、侵袭的机制研究

王捷 张亚楠 张瑜 高旭辉

食管癌(esophageal cancer)是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，其为中国癌症死亡的第四大原因[1]。尽管由于诊断、手术和放化疗技术的不断进展，但其化学抗性和转移倾向仍是影响食管癌预后的主要原因[2]。随着对癌症生物学的进一步研究，越来越多的研究人员开始探索新的治疗方法，miRNA、siRNA或核酶的寡核苷酸疗法的特异性和安全性得到关注。miRNA是长度在18～24个核苷酸之间的短链非编码内源性微小RNA，其参与人类多种疾病的发生发展[3]。miR-186-5p在多种癌症中均下调，发挥抑制癌症进一步恶化的作用[4]，但是其在食管癌中的作用及机制尚未十分清楚。神经营养因子受体B(TrkB-T1)是一种145 kDa受体酪氨酸激酶，是人类癌症中肿瘤发生发展的关键调节因子[5]。失调的TrkB-T1在多种癌症的进程中均具有重要作用[6,7]。本研究以食管癌细胞ECA109为研究对象，检测其中miR-186-5p、TrkB-T1的表达，观察过表达miR-186-5p、敲减TrkB-T1、过表达TrkB-T1对食管癌细胞迁移侵袭及EMT的影响，揭示其机制与miR-186-5p靶向TrkB-T1相关，为食管癌的治疗提供新靶标。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常食管上皮细胞HEEC、食管癌细胞ECA109、TE1、KYSE150均购自ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连TaKaRa；Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Coming公司；PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司；SDS-PAGE 试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将人正常食管上皮细胞HEEC、食管癌细胞ECA109、TE1、KYSE150，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例更换培养基，传代。

1.2.2 细胞转染与分组:将miR-NC、miR-186-5p mimics、si-NC、si-TrkB-T1、miR-186-5p+pcDNA、miR-186-5p+pcDNA-LRIGl按照脂质体Lipofectamine TM2000说明书操作步骤要求转染至EJ细胞，分别标记为miR-NC组、miR-186-5p组、si-NC组、si-TrkB-T1组、miR-186-5p+pcDNA组、miR-186-5p+pcDNA-LRIGl组，转染48 h后，用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.2.3 qRT-PCR实验检测细胞中miR-186-5p、TrkB-T1的mRNA表达:取适量对数生长期1.2.2各组细胞，遵照RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA，进行定量，然后按逆转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行miR-186-5p、TrkB-T1检测。用2-ΔΔCt计算miR-186-5p、TrkB-T1的表达。

1.2.4 Western blot实验检测细胞中TrkB-T1、Twist、N-cadherin、E-cadherin的蛋白表达:收集细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加发光液，曝光。

1.2.5 Transwell小室检测细胞的迁移侵袭:将细胞以106个/孔接种于细胞6孔板，培养至融合度75%时，更换无血清培养基培养过夜。调整细胞密度至105个/ml，取100 μl加入上室内，600 μl含血清的培养基加入下室，培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS洗涤，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞数，随机选5个视野计数，取平均值。将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性:采用在线靶基因预测库targetscan(http://www.targetscan.org/)检测到miR-186-5p与TrkB-T1 3’UTR存在结合位点，为验证这一预测，构建TrkB-T1 3’UTR-WT(含TrkB-T1 3’UTR片段)和TrkB-T1 3’UTR-MUT(含TrkB-T1 3’UTR片段突变体)的荧光素酶报告载体，采用LipofectamineTM2000分别将TrkB-T1 3’UTR-WT和TrkB-T1 3’UTR-MUT与miR-186-5p、miR-NC共转染，转染24 h后，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作，记录萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶激发值，以二者的比值评价TrkB-T1基因的荧光活性。

2 结果

2.1 miR-186-5p、TrkB-T1在食管癌细胞中的表达 与HEEC比较，食管癌细胞ECA109、TE1、KYSE150中miR-186-5p的mRNA表达显著降低，TrkB-T1的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)。见表1，图1。

表1 miR-186-5p、TrkB-T1在食管癌细胞中的表达

图1 TrkB-T1在食管癌细胞中的蛋白表达

2.2 过表达miR-186-5p对食管癌细胞迁移侵袭及EMT相关蛋白表达的影响 与miR-NC组比较，miR-186-5p组ECA109细胞中miR-186-5p表达显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，Twist、N-cadherin蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表2，图2。

表2 过表达miR-186-5p对食管癌细胞迁移侵袭及EMT相关蛋白表达的影响

图2 过表达miR-186-5p的食管癌细胞中EMT相关蛋白的表达

2.3 miR-186-5p靶向TrkB-T1 采用target scan数据库预测到miR-186-5p与TrkB-T1 3’UTR存在结合位点；双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-186-5p组WT-TrkB-T1细胞中荧光活性显著降低，MUT-TrkB-T1细胞中荧光活性不受影响；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-186-5p组细胞中TrkB-T1表达显著升高，与miR-NC组比较，miR-186-5p组细胞中TrkB-T1表达显著降低(P<0.05)。见表3、4，图3、4。

表3 双荧光素酶报告基因检测实验结果

表4 miR-186-5p对TrkB-T1蛋白表达的影响

图3 miR-186-5p与TrkB-T1的靶向结合位点

图4 TrkB-T1蛋白的表达

2.4 敲减TrkB-T1对食管癌细胞迁移侵袭及EMT相关蛋白表达的影响 与si-NC组比较，si-TrkB-T1组ECA109细胞中TrkB-T1表达显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，Twist、N-cadherin蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图5，表5。

表5 敲减TrkB-T1对TrkB-T1细胞迁移侵袭的影响

图5 敲减TrkB-T1的食管癌细胞中TrkB-T1蛋白表达

2.5 过表达TrkB-T1逆转miR-186-5p对食管癌细胞迁移侵袭、EMT的抑制作用 与miR-186-5p+pc DNA组比较，miR-186-5p+pc DNA-TrkB-T1组ECA109细胞中miR-186-5p表达显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高，Twist、N-cadherin蛋白表达显著升高，E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表6，图6。

表6 过表达TrkB-T1逆转miR-186-5p对食管癌细胞迁移侵袭、EMT的抑制作用

图6 过表达TrkB-T1逆转miR-186-5p对食管癌细胞EMT相关蛋白表达的影响

3 讨论

miRNA通过与靶基因的3’UTR发生特异性结合，抑制靶基因的转录或翻译，进而发挥调控作用[8]。miR-186在人类的多种癌症中均表现出失调，其中包括食管癌。Liu等[9]在食管癌的研究中通过高通量miRNA芯片检测发现，miR-186为表达异常降低的miRNA之一。Yan等[10]在研究中也有报道，miR-186是食管癌中差异最显著的miRNA之一。He等[11]在研究中报道，miR-186是食管癌中的低表达与癌症的分期、分化程度及淋巴转移具有显著的相关性，并且过表达miR-186可抑制癌细胞的增殖、迁移侵袭，促进凋亡，其机制与靶向SKP2有关，提示miR-186具有作为食管癌治疗的潜在靶点。本研究采用qRT-PCR检测了食管癌细胞中 miR-186-5p的mRNA的表达发现，miR-186-5p表达异常降低，这与前人的研究结果均相一致，再次验证了miR-186-5p在食管癌中的异常下调；进一步研究发现，过表达miR-186-5p可抑制食管癌细胞的迁移侵袭，下调促EMT标志蛋白Twist、N-cadherin的表达，上调抑EMT标志蛋白E-cadherin，证实了miR-186-5p抑制食管癌细胞迁移侵袭的功能，其机制可能与抑制细胞的EMT化密切相关；深入研究，通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测实验、Western blot实验发现，miR-186-5p可靶向负调控TrkB-T1的表达，推测miR-186-5p在食管癌中的功能可能与TrkB-T1的表达具有相关性。

TrkB-T1是TrkB-T1的可变剪接转录变体，具有独特的COOH-末端12-氨基酸序列，具有酪氨酸激酶的活性，主要位于细胞质[12]。Zhou等[13]发现，TrkB-T1在所有鳞状细胞癌中的表达均出现明显的上调，但是这种高表达与喉鳞癌的存活率低呈负相关，与肺癌的存活率呈正相关，其机制与调节hedgehog基因通路相关蛋白及Nfe2l2应答、Tp63、Keap1和p62/SQSTM1蛋白具有显著的相关性。Kupferman等[14]在头颈部鳞状细胞癌的研究中发现，用BDNF(TrkB的配体)体外刺激上调头颈部鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭，并且TrkB的瞬时和稳定抑制导致组成型和配体介导的迁移和侵袭的显著消除。此外，强制性过表达TrkB导致EMT的分子介质表达的改变，如E-钙粘蛋白的下调和Twist的上调，在头颈部鳞状细胞癌小鼠模型显示TrkB的下调抑制肿瘤生长，暗示TrkB参与EMT和头颈部鳞状细胞癌的侵袭，并且与头颈部鳞状细胞癌中TrkB的体内过表达相关。本研究通过qRT-PCR、Western blot实验检测了食管癌细胞中TrkB-T1的mRNA和蛋白表达发现，TrkB-T1异常升高，这与Zhou[13]的实验结果相呼应；进一步研究发现，敲减TrkB-T1可抑制食管癌细胞的迁移侵袭，下调Twist、N-cadherin，上调E-cadherin，这揭示了TrkB-T1在食管癌中的促进转移的功能，为深入探索TrkB-T1在食管癌的中功能提供新的参考；重要的是过表达TrkB-T1可逆转miR-186-5p对食管癌细胞的迁移侵袭和EMT的抑制作用，说明不仅miR-186-5p可靶向调控TrkB-T1，相反，TrkB-T1也可负向调控miR-186-5p在食管癌细胞中的表达和功能。

综上所述，miR-186-5p抑制食管癌细胞迁移侵袭和EMT，其机制与靶向负调控TrkB-T1有关，为食管癌的治疗提供新的作用靶点。