miR-365靶向调控IRAK1促进脓毒症血管内皮细胞增殖和抑制细胞凋亡

钟勇 贺珊珊 陈玉梅

脓毒症指烧伤、感染等引发的一种全身性炎性反应，严重时还可发展为急性呼吸窘迫综合征、感染性休克等造成患者死亡[1,2]。脓毒症发生时炎性因子及炎性介质的大量释放导致促炎因子、抗炎因子失衡从而造成机体免疫功能损伤[3]。因而如何降低炎性反应成为研究重点。研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)在炎性反应中发挥重要作用，并可作为诊断脓毒症的潜在生物标志物[4]。研究表明微小RNA-365(microRNA-365，miR-365)表达降低与脓毒症患者炎性因子释放量增加有关[5]。但miR-365在脓毒症发生过程中的作用机制尚未完全阐明。starBase预测显示白细胞介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)可能是miR-365的靶基因，研究表明脂多糖诱导的人胚肺成纤维细胞中IRAK1高表达并可促进炎性反应造成细胞损伤[6]。但miR-365是否通过调控IRAK1的表达从而参与脓毒症发生过程尚未可知。本研究采用体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)[7]，观察miR-365对脂多糖(lipopolysacharide，LPS)诱导的HUVECs炎性因子及细胞增殖、细胞凋亡的调节作用，并分析其对IRAK1的调控作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国ATCC公司；LPS购自美国eBioscience公司；EGM-2培养基购自北京毕特博生物技术有限责任公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；miR-365模拟物(mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-con)、miR-365特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-365)及阴性对照(anti-miR-con)均购自上海吉玛制药技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自北京百奥莱博科技有限公司；膜联蛋白V(annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)抗体均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol试剂、反转录试剂盒与荧光定量PCR试剂均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组:HUVECs培养于EGM-2培养基，培养条件：37℃、体积分数5%CO2，每2天更换1次培养液，细胞传代培养，选用第5代生长状态良好的细胞进行后续实验。采用DMEM培养基(10%)与90%胎牛血清进行细胞冻存。实验分组：空白组(未进行任何处理的HUVECs)、LPS组(使用浓度为10 μg/ml的LPS处理HUVECs 48 h)[8]、LPS+miR-con组(HUVECs中转染miR-con 48 h，使用浓度为10 μg/ml的LPS处理HUVECs 48 h)、LPS+ miR-365组(HUVECs中转染miR-365 48 h，使用浓度为10 μg/ml的LPS处理HUVECs 48 h)、LPS+ miR-365+pcDNA组(HUVECs中共转染miR-365 mimics、pcDNA 48 h，使用浓度为10 μg/ml的LPS处理HUVECs 48 h)、LPS+ miR-365+pcDNA-IRAK1组(HUVECs中共转染miR-365 mimics、pcDNA-IRAK1 48 h，使用浓度为10 μg/ml的LPS处理HUVECs 48 h)。

1.2.2 检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平:收集6组细胞培养液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-365、IRAK1 mRNA表达水平:采用Trizol法提取HUVECs总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书配置反应体系并进行PCR扩增得到cDNA，miR-365正向引物为5’-TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，反向引物为5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6正向引物为5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，反向引物为5’-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3’；IRAK1正向引物为5’-TGAAGAGGCTGAAGGAGAA-3’，反向引物为5’-CGTACACCAGGCAGTAGAAG-3’；β-actin正向引物为5’-AGCCTTCCTTCCTGGGCATGG-3’，反向引物为5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAGGTC-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。根据试剂盒说明书配置qRT-PCR反应体系，反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循环40次。置于实时荧光定量PCR仪检测，miR-365以U6为内参，IRAK1 以β-actin为内参，采用 2-ΔΔCt法计算miR-365、IRAK1 mRNA相对表达量。

1.2.4 MTT检测细胞增殖:取对数生长期HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬浮液，调整细胞密度为3×105个/ml，每孔100 μl细胞悬液接种于96孔板，按照“1.2.1”分组处理，每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室温条件下继续培养4 h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μl，置于微量振荡器中振荡10 min，置于酶标仪检测490 nm波长处光密度值(OD)，细胞存活率(%)=(各实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡:收集6组HUVECs，PBS洗涤细胞，0.25%胰蛋白酶消化，4℃条件下经10 000 r/min转速离心5 min，加入1 ml结合缓冲液，4℃条件下经10 000 r/min转速离心5 min，弃上清，加入200 μl结合缓冲液，加入5 μl Annexin V-FITC与PI，充分混匀，室温避光孵育20 min，加入400 μl结合缓冲液置于流式细胞仪检测并计算细胞凋亡率。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测:starBase预测显示miR-365与IRAK1的3’UTR存在结合位点，将含有结合位点及突变位点的IRAK1的3’UTR片段插入荧光素酶报告基因载体分别构建野生型载体WT-IRAK1与突变型载体MUT-IRAK1，分别将WT-IRAK1、MUT-IRAK1与miR-365 mimics、miR-con共转染至HUVECs，置于培养箱内继续培养48 h，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.7 蛋白免疫印迹(western blot)检测IRAK1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达:取6组HUVECs，加入蛋白裂解液提取蛋白，测定蛋白浓度，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白，将其移至PDVF膜，脱脂牛奶(5%)封闭，分别添加IRAK1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗(1∶500)，4℃孵育24 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，ECL化学发光法进行显影，采用Quantity One软件检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

2 结果

2.1 LPS诱导HUVECs对miR-365和IRAK1表达的影响 实验结果显示，与空白组比较，LPS组HUVECs中miR-365的表达水平显著降低(P<0.05)，IRAK1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。见表1,图1。

表1 LPS诱导HUVECs对miR-365和IRAK1表达的影响

图1 Western blot检测HUVECs中IRAK1蛋白表达

2.2 转染miR-365抑制LPS诱导HUVECs凋亡和促进细胞存活 与空白组比较，LPS组HUVECs存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达量均显著升高(P<0.05)；与LPS+miR-con组比较，LPS+ miR-365组HUVECs存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。见图2,表2。

图2 流式细胞术检测细胞凋亡和western blot检测Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达

表2 转染miR-365抑制LPS诱导HUVECs凋亡和促进细胞存活

2.3 转染miR-365抑制LPS诱导HUVECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌 实验结果显示，与空白组比较，LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05)；与LPS+miR-con组比较，LPS+ miR-365组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 转染miR-365抑制LPS诱导HUVECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌

2.4 miR-365靶向调控IRAK1表达 starBase预测显示miR-365与IRAK1存在靶向序列。双荧光素酶报告实验结果显示，转染野生型载体WT-IRAK1的细胞中，与miR-con组比较，miR-365组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；转染突变型载体MUT-IRAK1的细胞中，与miR-con组比较，miR-365组荧光素酶活性无明显变化。Western blot检测结果显示，与miR-con组比较，miR-365组HUVECs中IRAK1蛋白表达量显著降低(P<0.05)；相对于anti-miR-con组，anti-miR-365组HUVECs中IRAK1蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见图3,表4、5。

图3 miR-365靶向调控IRAK1表达

表4 双荧光素酶报告实验

表5 miR-365靶向调控IRAK1表达

2.5 过表达IRAK1部分逆转miR-365对LPS诱导HUVECs的保护作用 实验结果显示，与LPS+ miR-365+pcDNA组比较，LPS+ miR-365+pcDNA-IRAK1组HUVECs细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达量显著升高(P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05)。见图4，表6。

图4 western blot检测IRAK1、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达

表6 过表达IRAK1和转染miR-365对LPS诱导HUVECs保护作用的影响

3 讨论

手术、严重创伤后常可引发脓毒症，目前脓毒症的病理生理学机制尚未完全阐明，临床尚无治疗脓毒症的有效方法，研究表明脓毒症与免疫失调、炎性反应有关，炎性介质释放量增加可损伤血管内皮细胞导致血管通透性增加、凝血功能异常进而引发多器官功能障碍[9,10]。以上研究表明血管内皮细胞损伤与脓毒症的发生发展有关，因而探究血管内皮细胞损伤机制有助于揭示脓毒症的病理生理学机制。既往研究显示部分miRNA可参与脓毒症的病理过程并可调控相关细胞因子的表达[11]。因此本研究积极探寻新型miRNA并分析其对脓毒症血管内皮细胞损伤的影响及其可能的作用机制具有重要意义。

miR-365在膝骨关节炎患者中表达异常并可能参与膝骨关节炎的发生过程[12,13]。miR-365表达降低与脂肪肝炎性反应密切相关[14]。本研究中LPS诱导的HUVECs中miR-365表达下调，提示miR-365表达水平降低与脓毒症的发生有关。本文检测miR-365过表达对HUVECs增殖及凋亡的影响，结果显示LPS诱导的HUVECs存活率显著降低，而miR-365过表达可明显提高HUVECs存活率，说明miR-365过表达对LPS诱导的HUVECs增殖具有促进作用。进一步研究显示LPS诱导的HUVECs凋亡率显著升高，miR-365过表达可明显降低HUVECs凋亡率，说明miR-365过表达对LPS诱导的HUVECs凋亡具有明显抑制作用。线粒体通路是引起血管内皮细胞凋亡的主要途径，线粒体膜通透性增加可促使细胞色素C(Cyt-C)释放至细胞浆，Cyt-C与凋亡蛋白酶激活因子结合可激活Caspase-9，Caspase-9活化后可激活下游凋亡执行因子Caspase-3最终促使细胞凋亡[15]。本研究结果显示LPS诱导的HUVECs中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平升高，说明线粒体途径可能是LPS诱导HUVECs凋亡的机制之一，同时进一步研究发现miR-365过表达可明显降低Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表达，提示miR-365过表达可抑制线粒体途径进而抑制LPS诱导HUVECs凋亡。TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子与脓毒症发生过程密切相关，其水平升高可引发脓毒症患者全身炎性反应[16]。本研究结果显示LPS诱导HUVECs中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，而miR-365过表达可明显降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提示miR-365过表达可减轻LPS诱导HUVECs炎性反应。

IRAK1表达异常与口腔扁平苔藓患者体内的炎性反应密切相关[17]。研究表明IRAK1在糖尿病心肌病小鼠中呈高表达，miR-146可能通过调控IRAK1介导的炎性反应从而参与糖尿病心肌病发生过程[18]。研究表明抑制IRAK1的表达可阻滞炎性因子的释放从而减缓溃疡性结肠炎发展[19]。相关报道指出miR-142-3p过表达可通过抑制IRAK1的表达而减轻LPS诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)炎性反应[20]。本研究通过双荧光素酶报告实验证实IRAK1是miR-365的靶基因，miR-365可负向调控IRAK1的表达与活性，进一步研究显示IRAK1过表达可部分逆转miR-365对LPS诱导HUVECs的保护作用，提示miR-365过表达可通过抑制IRAK1的表达从而减轻LPS诱导HUVECs炎性反应、抑制HUVECs凋亡及促进HUVECs增殖，减缓脓毒症发生发展。

综上所述，miR-365可通过下调IRAK1的表达影响LPS诱导的HUVECs增殖、凋亡，并抑制血管内皮细胞炎性因子的分泌，可为揭示脓毒症发病机制提供新方向，可为降低脓毒症的发生率提供参考依据。