miR-582-5p通过靶向SOCS1基因调节皮肤黑色素瘤细胞迁移、侵袭和EMT的机制研究

李静 刘琴 柯锦

人类黑色素瘤是皮肤肿瘤中常见的恶性肿瘤，据统计，2018年，全球皮肤黑色素瘤新增病例为287 723例，死亡病例达60 712例[1]。黑色素瘤具有高度侵袭性，近1/3的黑色素瘤患者将经历疾病复发，大多数复发最终发展为转移性疾病[2]。然而，黑色素瘤的生长和转移机制仍不清楚。因此，需要进一步的研究来阐明黑色素瘤发生和发展的分子机制，以开发有希望的治疗方法。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一类内源性非编码RNA，在组织和细胞中特异性表达。迄今为止，已经确定了多个在黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭中发挥关键作用的miRNA，以及参与细胞凋亡、免疫应答、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的miRNA[3,4]，如miR-150-5p[5]、miR-27a[6]、miR-1297[7]、miR-22[8]，miRNA可能是黑色素瘤的有效治疗靶点。既往研究表明，微小RNA-582-5p(microRNA-582-5p，miR-582-5p)在人子宫内膜癌组织中的表达显著降低，miR-582-5p的上调抑制子宫内膜癌细胞增殖，促进细胞凋亡[9]。miR-582-5p通过靶向调控丝氨酸/苏氨酸激酶3(serine/threonine kinase 3，AKT3)抑制胃癌细胞增殖，诱导其凋亡[10]。上调miR-582-5p抑制人结肠癌细胞增殖、细胞周期进展和侵袭[11]。但miR-582-5p在黑色素瘤细胞中的生物学功能尚未明确。MiR-29a通过调节肿瘤抑制因子细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)的甲基化来抑制宫颈癌的侵袭和转移[12]，SOCS1基因沉默抑制人恶性黑色素瘤细胞和人胰腺癌细胞增殖[13,14]。基于此，本研究在体外培养黑色素瘤细胞，观察miR-582-5p对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、EMT的影响及对SOCS1的靶向关系，以探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人黑色素瘤细胞株(A375、G361、WM35、M14)购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，人类皮肤黑色素细胞(NHEM)、Melanocyte Growth Medium培养基购自瑞士LONZA公司，RPMI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，miR-582-5p、anti-miR-582-5p、pcDNA-SOCS1购自武汉淼灵生物科技有限公司，SOCS1、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β肌动蛋白(β-actin)购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自Abcam公司，异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 细胞培养 细胞A375、G361、WM35、M14培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，NHEM细胞培养于Melanocyte Growth Medium培养基，均在37℃、5%CO2的饱和湿润培养箱中生长。

1.3 RNA提取和qPCR反应 为了量化miR-582-5p和SOCS1 mRNA表达，使用TRIzol提取A375、G361、WM35、M14、NHEM细胞总RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA转化为cDNA，接下来进行qPCR。U6和β-actin分别用作miR-582-5p和SOCS1 mRNA表达的内参，使用2-ΔΔCt方法定量相对基因表达。引物序列如下：miR-582-5p正向5’-GCGGTTACAGTTGTTCAACC-3’，反向5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；内参U6正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；SOCS1正向5’-TGCGCCTCAAGACCTTCAG-3’，反向5’-CATCAGGCTCTCGCTTTTGGA-3’；内参β-actin正向5’-GTATCCTGACCCTGAAGTACC-3’，反向5’-TGAAGGTCTCAAACATGATCT-3’。

1.4 细胞转染 收集处于指数生长期的A375细胞，并在转染前1 d以1×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中。细胞密度达约70%时，根据制造商的方案，将miR-582-5p、anti-miR-582-5p、pcDNA-SOCS1使用Lipofectamine 2000试剂转染。转染后48 h，收获转染的A375细胞，分别用于后续检测。

1.5 蛋白质印迹(Western blot)分析 将细胞用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤2次，并用RIPA裂解液裂解。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)(10%凝胶)分离等量的总蛋白质(20 μg)，然后转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h后，将膜在4℃下与SOCS1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin一抗孵育过夜。用含有Tris缓冲盐的Tween-20溶液(tris buffered saline with Tween-20，TBST)充分洗涤后，在室温下加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h。最后，使用增强的化学发光液使免疫反应蛋白可视化。β-actin用作内参蛋白。

1.6 细胞增殖检测 使用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)评估A375细胞增殖的影响。收集转染的A375细胞，并将1×105个/ml密度的细胞接种到96孔板中。在37℃，5%CO2下孵育24、48、72 h后，通过向每孔细胞中加入20 μl MTT溶液进行MTT测定，然后将细胞在37℃孵育4 h，加入150 μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，37℃孵育10 min，最后，使用酶标仪测定波长490 nm的吸光度(OD 490 nm)。

1.7 细胞凋亡测定 根据Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明，通过流式细胞仪分析A375细胞凋亡。调整转染后的A375细胞密度为1×106个/ml，分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温避光反应15 min，上机检测。

1.8 Transwell迁移、侵袭实验

1.8.1 Transwell迁移实验：用于鉴定A375细胞的迁移能力，收获转染后的A375细胞并悬浮在不含血清的RPMI-1640培养基，总计5×104个细胞置于Transwell上室。将含血清的RPMI-1640培养基作为化学引诱剂添加至Transwell下室。孵育24 h后，使用棉签轻轻擦去非迁移性细胞。将迁移性细胞用4%甲醛在37℃固定15 min，并用0.1%结晶紫在37℃染色30 min，统计迁移细胞数。

1.8.2 Transwell侵袭实验：用于鉴定A375细胞的侵袭能力，事先用50 μl与无血清培养基混匀的Matrigel包被Transwell上室，静置3～4 h。其余步骤同Transwell迁移实验。

1.9 生物信息学分析和荧光素酶报告基因测定 数据库TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测出SOCS1是miR-582-5p的靶标之一。分别构建SOCS1的野生型(WT)和突变型(MUT)3’非编码区(3’untranslated region，3’UTR)质粒，标记为WT-SOCS1、MUT-SOCS1，利用Lipofectamine 2000将miR-582-5p或miR-con共转染入A375细胞，转染48 h测定荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-582-5p 和SOCS1在人黑色素瘤细胞和人类皮肤黑色素细胞中的表达 qPCR检测数据显示，miR-582-5p在人黑色素瘤细胞株A375、G361、WM35、M14细胞中的表达量明显低于人类皮肤黑色素细胞NHEM细胞(P<0.05)，选择miR-582-5p表达量最低的A375细胞开展后续实验。对SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表达的检测结果表明，A375、G361、WM35、M14细胞中SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表达量显著高于NHEM细胞(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western blot检测黑色素瘤细胞和人类皮肤黑色素细胞中SOCS1的表达

表1 miR-582-5p 和SOCS1在人黑色素瘤细胞及人类皮肤黑色素细胞中的表达

2.2 miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞A375增殖和细胞凋亡的影响 在A375细胞中转染miR-582-5p，其表达量较miR-con组大幅升高(P<0.05)。MTT对A375细胞增殖的检测结果表明，与miR-con组比较，miR-582-5p过表达对24 h的细胞活性无明显影响，而显著降低48 h、72 h的细胞活性(P<0.05)。流式细胞术检测A375细胞凋亡，结果显示，miR-582-5p过表达较miR-con组明显提高细胞凋亡率(P<0.05)。见图2，表2。

图2 miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞A375凋亡的影响

表2 miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

2.3 miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞A375迁移和侵袭的影响 Transwell小室法检测细胞A375迁移和侵袭，结果表明，与miR-con组比较，miR-582-5p过表达明显减少迁移细胞数和侵袭细胞数(P<0.05)。Western blot检测细胞A375中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表达，发现miR-582-5p过表达组N-cadherin、Vimentin表达量显著低于miR-con组，E-cadherin蛋白水平明显高于miR-con组(P<0.05)。见图3，表3。

表3 miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞A375迁移、侵袭的影响

图3 miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞A375迁移、侵袭的影响；A Transwell检测人黑色素瘤细胞A375迁移和侵袭；B Western blot检测N-cadherin、E-cadherin、Vimentin的表达

2.4 miR-582-5p靶向调控SOCS1的表达 生物信息学预测miR-582-5p的靶基因，结果显示，SOCS1的3’UTR中部分核苷酸序列可与miR-582-5p 互补配对。双荧光素酶报告实验检测发现，与miR-con组比较，miR-582-5p明显降低WT-SOCS1的荧光素酶相对活性(P<0.05)，但对MUT-SOCS1的荧光素酶相对活性无显著影响。Western blot检测SOCS1蛋白的表达，结果表明，miR-582-5p比miR-con组明显减少SOCS1蛋白表达量(P<0.05)，anti-miR-582-5p较anti-miR-con组显著提高SOCS1蛋白水平(P<0.05)。见图4，表4、5。

图4 miR-582-5p 靶向调控SOCS1的表达;A SOCS1的3’UTR中含有与miR-582-5p 互补的核苷酸序列；B Western blot检测人黑色素瘤细胞 SOCS1蛋白表达

表4 双荧光素酶报告实验

2.5 过表达SOCS1逆转了miR-582-5p 过表达对人黑色素瘤细胞A375增殖、迁移、侵袭和凋亡的调控作用与miR-con组比较，miR-582-5p过表达明显降低A375细胞48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白水平(P<0.05)，显著增加细胞凋亡率、E-cadherin蛋白表达量(P<0.05)。同miR-582-5p +pcDNA组相比，miR-582-5p 和 pcDNA-SOCS1共转染明显提高A375细胞48h、72h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白水平(P<0.05)，显著减少细胞凋亡率、E-cadherin蛋白表达量(P<0.05)。见表6、7，图5。

图5 Western blot检测人黑色素瘤细胞A375中SOCS1、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表达

表5 miR-582-5p 调控SOCS1蛋白的表达

表6 过表达SOCS1逆转了miR-582-5p 过表达对人黑色素瘤细胞A375增殖、迁移、侵袭和凋亡的调控作用

3 讨论

在所有皮肤肿瘤中，黑色素瘤是最具侵袭性的一种，因为它具有快速转移性、对传统放射线和化疗的耐药性[15]。黑色素瘤也是皮肤癌死亡的主要原因，更全面地了解黑色素瘤发生发展的分子机制对于提高该病的诊断、预后和治疗至关重要。考虑到早期发现黑色素瘤的存活率更高，早期发现黑色素瘤的精确诊断测试将十分有利。此外，由于当肿瘤转移时，患者的存活率急剧下降，因此有必要改进诊断工具，更精确地识别高危患者并预测治疗反应。

表7 过表达SOCS1逆转了miR-582-5p过表达对人黑色素瘤细胞中SOCS1、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin表达的影响

miRNA是高度保守的短链RNA，由18到25个核苷酸组成[16]，具有广泛的生物活性。miRNA通过与下游靶基因3’UTR的特定序列结合，导致mRNA降解和/或翻译抑制，在许多细胞过程，如增殖、分化、细胞衰老、自噬和迁移等发挥重要作用[17]。已经在各种类型的恶性肿瘤中鉴定出miRNA异常表达，包括黑色素瘤[18]。因此，研究黑色素瘤相关miRNA的作用和潜在的分子机制对于开发新的诊断生物标志物和有效的治疗靶标是必不可少的。本实验检测了miR-582-5p在黑色素瘤中的表达水平，确定miR-582-5p在黑色素瘤发展中的详细作用。结果显示，miR-582-5p在人黑色素瘤细胞株A375、G361、WM35、M14细胞中表达明显下调，这与其在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)临床标本和细胞系中表达下调的结果一致[19]。同时，Wang等[19]的研究还发现，miR-582-5p过表达显著抑制体外NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，其发挥肿瘤抑制活性与靶向调控丝裂原活化蛋白激酶激酶2(mitogen activated protein kinase kinase 2，MAP3K2)基因有关。Liu等[20]学者也观察到miR-582-5p在NSCLC组织中的表达低于癌旁组织；miR-582-5p的异位表达显著抑制NCI-H358细胞增殖和侵袭；miR-582-5p下调时则相反，细胞生长速度加快，PC-9细胞侵袭能力增强。Zhang等[21]报道指出，miR-582-5p在肝癌组织和细胞系中表达下调，在G0/G1期上调miR-582-5p可减少菌落数量，抑制细胞增殖，抑制细胞周期；当miR-582-5p被抑制时，菌落数量增加，细胞增殖和细胞周期得到促进。本研究中，功能实验表明，miR-582-5p过表达明显抑制黑色素瘤细胞A375的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，与前述研究相符。

与胚胎发育相似，EMT的细胞表型变化也在致瘤过程中发挥作用[22]。EMT过程是促进肿瘤进展和转移的重要现象，构成了肿瘤细胞表型特征的改变，使其具有更强的侵袭性[23]。Wang等[24]利用微阵列分析显示，与匹配的邻近正常组织相比，涎腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)样本中miR-582-5p显著下调；miR-582-5p表达通过靶向叉头框C1(forkhead box C1，FOXC1)显著影响细胞的迁移、侵袭和增殖能力；随着FOXC1的下调，E-cadherin升高，而Vimentin和snail蛋白降低，说明FOXC1可能通过使snail转活来调控SACC细胞的EMT。本研究中，miR-582-5p过表达明显降低A375细胞的N-cadherin、Vimentin蛋白表达，显著提高E-cadherin蛋白水平(P<0.05)，表明miR-582-5p对黑色素瘤细胞的EMT过程具有抑制作用。

几种基因已被确定为miR-582-5p的直接靶标，包括AKT3[9,10]、Rab27a[11]、MAP3K2[19]、缺口受体1(notch receptor 1，NOTCH1)[20]、细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1，CDK1)[21]。本实验对miR-582-5p调节黑色素瘤发展的潜在分子机制展开进一步研究。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告实验，证实SOCS1是黑色素瘤细胞中miR-582-5p的直接靶标。SOCS1属于SOCS家族，是癌症发生的关键基因。先前报道，与正常卵巢组织相比，卵巢癌标本中SOCS1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P=0.0215)[25]，与本研究结果一致。研究表明，SOCS1有利于黑色素瘤EMT，促进肿瘤进展，抑制抗肿瘤免疫；调控程序性细胞死亡1配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)表达可能解释了这些作用；SOCS1的沉默导致B16F10-Nex2黑色素瘤细胞的致瘤表型部分逆转，抑制了细胞的迁移和侵袭[26]，提示靶向SOCS1可能是治疗黑色素瘤患者一种有前景的方法。

总之，miR-582-5p在黑色素瘤中表达下调，miR-582-5p过表达通过直接靶向SOCS1调控黑色素瘤细胞A375的增殖、迁移、侵袭、凋亡和EMT，为黑色素瘤的治疗提供了潜在的生物标志物和有效靶点。