舒芬太尼调控LINC00668对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响*

王亚娟 宫伟 黄珊

(1.保定市妇幼保健院麻醉科，河北 保定 071000；2.保定市第一医院麻醉科，河北 保定 071000)

卵巢癌是影响女性生命健康的妇科肿瘤之首，手术是其主要治疗方法[1-2]。舒芬太尼是一种强效的阿片类镇痛药，镇痛作用强，作用时间长，不良反应少，常用于全身麻醉及术后镇痛等[3-4]。近年来研究报道，麻醉药具有抑癌作用，如舒芬太尼可抑制人肺腺癌A549细胞增殖并促进其凋亡[5]，还可以使胃癌SGC-7901细胞的活力下降，促进胃癌细胞凋亡[6]。然而舒芬太尼对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及机制尚不清楚。研究表明长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)参与癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等，影响肿瘤的发生和发展，lncRNA可作为肿瘤早期诊断、治疗和判断预后的潜在靶向标记物[7-8]。研究报道长基因间非编码RNA 668(Long intergenic non-coding RNA 668，LINC00668)的表达水平与喉鳞状细胞癌患者病理分化程度、T分期、临床分期和宫颈淋巴结转移有关，敲低LINC00668可以抑制喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[9]。新鱼腥草酸钠通过LINC00668/miR-147a/slug轴抑制非小细胞肺癌细胞的转移[10]。但LINC00668对卵巢癌细胞是否有影响以及是否受舒芬太尼影响还尚未可知。本实验旨在研究舒芬太尼对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制是否与调控LINC00668有关，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 A2780细胞购自上海泽叶生物科技有限公司；枸橼酸舒芬太尼注射液(国药准字H20054172)购自宜昌人福药业股份有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自武汉纯度生物科技有限公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自美国Progema公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、蛋白提取试剂盒、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自碧云天生物技术研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；FACSCanto II流式细胞仪购自美国 Bio-Rad公司。荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 细胞处理与分组 A2780细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5% CO2条件下培养，取对数生长期细胞，分别给予终浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的舒芬太尼处理A2780细胞，分别记为实验1、2、3组，正常培养的细胞作为对照组；将LINC00668小干扰RNA阴性对照(si-NC)、LINC00668小干扰RNA(si-LINC00668)分别转染至A2780细胞中，记为si-NC组、si-LINC00668组；将LINC00668过表达质粒阴性对照(pcDNA3.1)、LINC00668过表达质粒(pcDNA3.1-LINC00668)转染至A2780细胞中，同时用100 ng/mL的舒芬太尼处理，记为实验3组+pcDNA3.1组、实验3组+pcDNA3.1-LINC00668组。

1.3 流式细胞仪检测细胞周期 各组细胞培养24h后收集细胞，并制备单细胞悬液，加入3 mL预冷的70%乙醇固定，用P缓冲液洗涤后加入核糖核酸酶A(RNase A)于37℃水浴30 min，加入碘化啶(PI)，避光30 min，上机检测，重复3次。用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行检测分析。

1.4 CCK-8检测细胞存活率 选择各组转染后培养24 h的细胞，每孔中加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测各组细胞490 nm波长处的吸光度值(OD)。细胞增殖活力(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次。

1.5 蛋白质印迹(Western blot)法检测Ki67、pro-caspase-3、clv-caspase-3蛋白表达 各组细胞培养24 h后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再分别加入一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室温孵育90 min，TBST洗涤，用ECL发光液显影，用ChemiDoc XRS+系统成像，用Quantity One凝胶分析软件测定各组蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.6 实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测LINC00668表达水平 各组细胞培养24 h，提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3个重复，循环条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。LINC00668以GAPDH为内参，LINC00668上游引物序列：5′-GCGCTTTTGGAAGC AGTAAG-3′，下游引物序列：5′-TCCGAGCTCAGA CAGTGATG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTG CCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTC CACGACGTACTCAGCG-3′。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 取转染24 h后生长状态良好的细胞，吸弃上清液，PBS漂洗细胞2次，吸弃PBS液，加1～2 mL胰酶消化细胞使之脱壁，静置5～8 min，轻摇使之形成均匀细胞悬液，结合缓冲液终止消化，分别加Annexin V-FITC和PI各5 μL，轻摇混匀，再加入结合缓冲液350 μL，混匀，常温避光孵育15 min，流式细胞仪检测。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均数SymbolqB@标准差表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舒芬太尼对A2780增殖的影响 与对照组相比，舒芬太尼实验2、3组G0期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(P<0.05)，G2期细胞所占比例无显著变化(P>0.05)；细胞存活率显著降低，Ki67表达水平显著降低(P<0.05)；而舒芬太尼实验1组数据均无显著变化，见图1、表1。

图1 Ki67蛋白的表达

表1 舒芬太尼对A2780增殖的影响

2.2 舒芬太尼对A2780凋亡及LINC00668表达的影响 与对照组相比，舒芬太尼实验2、3组LINC00668表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，pro-caspase-3表达水平显著降低，clv-caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)；而舒芬太尼实验1组均无显著变化，见图2、表2。

表2 舒芬太尼对A2780凋亡的影响

图2 舒芬太尼对A2780凋亡及caspase-3蛋白表达的影响

2.3 抑制LINC00668对A2780增殖、凋亡的影响 与si-NC组相比，si-LINC00668组G0期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(P<0.05)，G2期细胞所占比例无显著变化(P>0.05)；细胞存活率显著降低，Ki67表达水平显著降低(P<0.05)；LINC00668表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，pro-caspase-3表达水平显著降低，clv-caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)，见图3、表3、表4。

图3 抑制LINC00668对A2780凋亡及Ki67、caspase-3蛋白表达的影响

表3 抑制LINC00668对A2780增殖的影响

表4 抑制LINC00668对A2780凋亡的影响

2.4 过表达LINC00668能逆转舒芬太尼对A2780增殖的影响 与实验3组+pcDNA3.1组相比，实验3组+pcDNA3.1-LINC00668组G0期细胞所占比例显著降低，S期细胞所占比例显著升高(P<0.05)，G2期细胞所占比例无显著变化(P>0.05)；细胞存活率显著升高，Ki67表达水平显著升高(P<0.05)，见图4、表5。

表5 过表达LINC00668能逆转舒芬太尼对A2780增殖的影响

图4 Ki67蛋白的表达

2.5 过表达LINC00668能逆转舒芬太尼对A2780凋亡的影响 与实验3组+pcDNA3.1组相比，实验3组+pcDNA3.1-LINC00668组LINC00668表达水平显著升高，细胞凋亡率显著降低，pro-caspase-3表达水平显著升高，clv-caspase-3表达水平显著降低(P<0.05)，见图5、表6。

图5 过表达LINC00668能逆转舒芬太尼对A2780凋亡及caspase-3蛋白表达的影响

表6 过表达LINC00668能逆转舒芬太尼对A2780凋亡的影响

3 讨论

研究表明，部分麻醉药具有抗肿瘤的作用[11]。舒芬太尼浓度≥5ng/mL时，可剂量依赖性抑制胃癌SGC-7901细胞的活力[12]；浓度>0.5ng/mL时可抑制食管鳞癌细胞的增殖，促进癌细胞的凋亡[13]。舒芬太尼还能通过改变肝癌细胞的细胞周期，促进细胞凋亡，抑制Hep3B细胞的活性[14]，也可通过上调Caspase-3的表达，促进大鼠肝癌瘤细胞凋亡[15]。本实验用25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的舒芬太尼处理的卵巢癌A2780细胞，研究其对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果显示，50 ng/mL、100 ng/mL舒芬太尼处理的A2780细胞中G0期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低，G1期细胞所占比例无显著变化；且细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，Ki67、pro-caspase-3表达水平显著降低，clv-caspase-3表达水平显著升高；Ki67是细胞增殖核抗原，研究表明抑制Ki67表达可抑制人卵巢癌OVCAR3细胞的增殖、并降低迁移及侵袭能力[16]。caspase-3介导的蛋白酶级联反应是细胞凋亡发生的重要途径之一，当外界信号刺激细胞凋亡时，caspase-3前体pro-caspase-3是细胞凋亡级联反应的关键执行者，其活化为clv-caspase-3，进而激活下游因子，促进细胞凋亡[17-18]。说明舒芬太尼可阻滞A2780细胞周期，抑制A2780细胞增殖、促进细胞凋亡；其可能与阻滞细胞周期和调节细胞凋亡相关蛋白表达有关。

研究报道LINC00668在乳腺癌中高表达，与乳腺癌患者的预后呈负相关，LINC00668可通过抑制细胞凋亡和加速细胞周期来促进乳腺癌的发展[19]。LINC00668的高表达水平与晚期TNM分期，组织学分级和淋巴结转移有关；敲低LINC00668可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和侵袭，并促进细胞凋亡[20]，还可抑制结肠直肠癌细胞增殖和迁移潜能并诱导细胞凋亡[21]。以上结果均表明LINC00668参与调控多种肿瘤的发生发展过程，且其在肿瘤中可能起促癌作用。本实验将LINC00668抑制表达载体转染至2780细胞中，结果显示，G0期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低，G1期细胞所占比例无显著变化；细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，Ki67、pro-caspase-3表达水平显著降低，clv-caspase-3表达水平显著升高。说明抑制LINC00668表达可抑制卵巢癌A2780细胞增殖、促进细胞凋亡。还有研究报道，麦冬素B通过LINC00668/miR-432-5p/皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)轴抑制人肺腺癌细胞A549的转移[22]。本实验结果显示，50 ng/mL、100 ng/mL舒芬太尼处理的A2780细胞中LINC00668表达水平显著降低；且过表达LINC00668逆转了舒芬太尼对A2780增殖、凋亡的影响。说明舒芬太尼可能通过LINC00668影响卵巢癌A2780细胞增殖、凋亡。

4 结论

本研究结果显示，舒芬太尼可能通过下调LINC0 0668的表达抑制卵巢癌细胞增殖，促进细胞凋亡。