干扰LINC00308促进miR-634对前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响*

魏仁波 张唯力 卓晖 杨镒魟 熊黎强 杨鹏 魏武然 曹敏

(1.成都市第三人民医院泌尿外科,四川 成都 610031；2.重庆医科大学附属第二医院泌尿外科,重庆 400010；3.四川大学华西第二医院男科,四川 成都 610041；4.成都市第三人民医院病理科,四川 成都 610031；5.四川大学华西医院泌尿外科,四川 成都 610041)

前列腺癌是男性常见癌症，也是全世界癌症相关死亡的主要原因之一[1]。在大多数国家或地区，新诊断出的前列腺癌病例数正在增加[2-3]。尽管目前拥有早期前列腺癌患者的治疗选择(例如手术、激素治疗和放射疗法等)，但对于晚期疾病患者，其5年生存率仍然很低[4]。因此，有必要描述前列腺癌发展中涉及的分子机制，以发现新颖的和重要的潜在诊断标志物与治疗靶标。长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)曾经被认为是转录噪声，然而，它在各种水平上发挥着重要的功能，如X染色体失活，染色质重塑和转录抑制[5]，影响包括前列腺癌在内的许多不同癌症类型的生物学功能。据报道，LINC00308在前列腺癌中高表达，是前列腺癌发生的重要因素[7]。但是，LINC00308在前列腺癌中的生物学功能和潜在机制仍然难以捉摸。微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-25个核苷酸组成的小型非编码RNA，可通过对其靶mRNA的负调控来调节多种生物过程[8]，它们已被确定为癌基因或抑癌基因来影响癌症的发生发展。作为一种新型的肿瘤抑制因子，miR-634可以抑制子宫颈癌细胞的增殖，迁移和侵袭[9]。miR-634在胃癌组织和细胞系中的表达水平明显低于正常邻近组织和对照细胞，其过表达抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭[10]。迄今为止，LINC00308对miR-634调控的作用尚不清楚。因此，本研究探讨了LINC00308和miR-634对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及二者的靶向关系，为前列腺癌发病机制研究提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集了33例于2017年2月～2017年11月，在本院经手术切除的前列腺癌和相邻的无肿瘤组织标本。所有病例均经病理学诊断确诊，并且获得标本手术前未进行任何化学疗法，放射疗法或其他前列腺癌治疗方法。所有实验均经医院医学伦理委员会批准，获得所有患者的知情同意。将前列腺癌组织和癌旁组织立即置于液氮中，提取RNA进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析。

1.1.2 细胞与试剂 前列腺癌细胞系PC-3M和DU145购自美国典型培养物保藏中心，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体、兔抗细胞核相关抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)抗体、兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)抗体购自美国Abcam公司，针对LINC00308的小干扰RNA(LINC00308 siRNA，si-LINC00308)、小干扰RNA阴性对照si-NC、miR-634 mimic、阴性对照miR-NC购自上海GenePharma公司，磷脂酰结合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒购自南京KeyGen公司，细胞周期分析试剂盒购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 将PC-3M和DU145细胞在含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，并保持在37℃、5% CO2的潮湿气氛中生长。转染前一天在24孔板中接种PC-3M和DU145细胞(1×105个细胞/孔)。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000将si-LINC00308或si-NC(100 nM)、miR-634 mimic、miR-NC转染到细胞中。转染后4 h，用完全RPMI 1640培养基代替转染培养基，再培养48 h。转染后，在4℃下12 000×g离心15 min后收集细胞，并通过qRT-PCR检测干扰或过表达效率。

1.2.2 qRT-PCR 为了检测LINC00308、miR-634表达，使用Trizol试剂从前列腺癌组织或转染后的PC-3M和DU145细胞中提取总RNA。根据制造商的规程，使用PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录为cDNA。然后使用SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒进行qRT-PCR。所用引物如下：LINC00308 5′-CAGATAAGACTCTGTCTACCCT-3′(正向)和5′-ACTGAATAAAGGAATGATGCGT-3′(反向)；GAPDH 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′(正向)和5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′(反向)；miR-634 5′-CAGTCTCAAACCAGCACC-3′(正向)和5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′(反向)；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)。其中GAPDH、U6用作内源性对照。所有样品均在ABI 7900实时PCR系统运行。使用2-ΔΔCt公式进行LINC00308、miR-634相对表达水平的计算。

1.2.3 细胞增殖分析 以细胞周期反映细胞的增殖能力。收集转染后的PC-3M和DU145细胞，在4℃的70%冷乙醇中固定4 h。用冷磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤细胞两次，并在37℃黑暗中用含有100 mg/mL PI和20 mg/mL RNase A的溶液染色30 min。使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行分析，并使用FlowJ软件对细胞周期分布进行定量。

1.2.4 细胞凋亡评估 根据制造商的说明，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪检测PC-3M和DU145细胞凋亡。收集转染后的PC-3M和DU145细胞，用PBS洗涤两次，然后悬浮于500 μL含有Annexin V-FITC(5 μL)和PI染色溶液中。在黑暗中孵育30 min后，通过流式细胞仪分析细胞。早期细胞凋亡由Annexin V+/PI-定义，晚期细胞凋亡由Annexin V+/PI+染色定义，细胞凋亡率为早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞之和。

1.2.5 双荧光素酶报告实验 starBase网站预测LINC00308的潜在靶标，发现LINC00308与miR-634部分碱基可形成互补配对。分别合成包含二者结合位点的野生型(WT)或突变型(MUT)LINC00308序列，并将其克隆到pmirGLO荧光素酶载体中，以生成WT-LINC00308或MUT-LINC00308。转染前24 h，将PC-3M细胞以每孔5×103个细胞的密度接种到24孔板中。使用Lipofectamine 2000将PC-3M细胞与miR-634 mimic或miR-NC和WT-LINC00308或MUT-LINC00308共转染。48 h后，用双重荧光素酶报告基因测定系统测定荧光素酶活性。

1.2.6 蛋白质印迹法(Western Blot) 对于Ki67、Caspase3蛋白水平检测，使用RIPA缓冲液分离转染后的PC-3M和DU145细胞的总蛋白，并使用双辛可宁酸蛋白测定试剂盒进行定量。通过SDS-PAGE分离20 μg蛋白质裂解物，并转移到硝酸纤维素膜上。在室温下，用5%脱脂奶粉将膜封闭1 h，与所需的一抗在4℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗在室温下以1∶5000的稀释度孵育1 h。洗涤后，用ECL试剂可视化目标蛋白条带，使用Quantity One软件通过光密度测定法定量蛋白水平。其中，Ki67、Caspase3和参照蛋白GAPDH的抗体均为1：1000稀释。

2 结果

2.1 LINC00308在前列腺癌中的表达 qRT-PCR检测33例前列腺癌标本中LINC00308的表达情况，见表1，数据显示，LINC00308在前列腺癌组织中的表达水平远远高于癌旁组织(P<0.05)。

表1 LINC00308在前列腺癌中的表达

2.2 干扰LINC00308对PC-3M和DU145增殖凋亡的影响 qRT-PCR检测LINC00308、miR-634的表达(表2、表3)，发现与si-NC组相比，干扰LINC00308明显降低PC-3M和DU145细胞中LINC00308的表达水平，显著提高miR-634的表达水平(P<0.05)。对细胞周期检测结果显示(表2、表3)，与si-NC组相比，干扰LINC00308明显增加PC-3M和DU145细胞的G0-G1期细胞比例，显著减少S期细胞比例(P<0.05)，而G2-M期细胞比例无明显变化(P>0.05)。对细胞凋亡的测定结果表明(图1、表2、表3)，干扰LINC00308后，PC-3M和DU145细胞的凋亡率明显高于si-NC组(P<0.05)。

表2 干扰LINC00308对PC-3M增殖凋亡的影响

表3 干扰LINC00308对DU145增殖凋亡的影响

图1 干扰LINC00308对PC-3M和DU145凋亡的影响

2.3 LINC00308靶向miR-634 生物信息学软件对LINC00308与miR-634的结合进行预测(图2)，结果显示，二者存在靶向结合位点。双荧光素酶报告实验的分析结果表明(表4)，与miR-NC组相比，miR-634组转染WT-LINC00308的PC-3M细胞荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，转染MUT-LINC00308的细胞荧光素酶活性变化不显著(P>0.05)。

图2 LINC00308靶向miR-634

表4 双荧光素酶报告实验

2.4 miR-634对PC-3M和DU145增殖凋亡的影响 qRT-PCR检测转染后miR-634 mimic的表达，发现与miR-NC组相比，转染miR-634 mimic明显提高PC-3M和DU145细胞中miR-634的表达水平(P<0.05)。对细胞周期检测结果显示，与miR-NC组相比，转染miR-634 mimic明显增加PC-3M和DU145细胞的G0-G1期细胞比例，显著减少S期细胞比例(P<0.05)，而G2-M期细胞比例无显著变化(P>0.05)。对细胞凋亡的分析结果表明，转染miR-634 mimic后，PC-3M和DU145细胞的凋亡率明显高于miR-NC组(P<0.05)，见图3、表5、表6。

图3 miR-634对PC-3M和DU145凋亡的影响

表5 miR-634对PC-3M增殖凋亡的影响

表6 miR-634对DU145增殖凋亡的影响

2.5 Western Blot检测Ki67、Caspase3蛋白的表达 Western Blot检测Ki67、Caspase3蛋白的表达(图4、表7)，结果显示，与si-NC组相比，干扰LINC00308明显降低PC-3M和DU145细胞的Ki67蛋白水平，和显著提高Caspase3蛋白水平(P<0.05)；与miR-NC组相比，转染miR-634 mimic明显降低PC-3M和DU145细胞的Ki67蛋白水平，并显著提高Caspase3蛋白水平(P<0.05)。

图4 PC-3M和DU145中Ki67、Caspase3蛋白的表达

表7 Ki67、Caspase3蛋白的表达

3 讨论

前列腺癌是男性的主要健康问题，目前尽管早期诊断和治疗策略的发展取得了许多进展，但前列腺癌仍然是一种致死性疾病[11-12]。因此，迫切需要探索导致前列腺癌发生的调控机制，这将有助于确定新的治疗靶点和开发有效的治疗方法[13]。这项研究的数据表明，LINC00308在前列腺癌中表达上调，干扰其表达可以抑制前列腺癌细胞的进展，其作用机制与靶向miR-634有关。

lncRNA代表一类新型的非编码RNA，其长度超过200个核苷酸，并且不具有蛋白质编码潜[14]。最近，发现lncRNA在癌症中失调和参与各种癌症的生物过程，如增殖，细胞凋亡，迁移和侵袭[15-16]。在以前的研究中，LINC00308被发现参与了前列腺癌的发生和发展，LINC00308在前列腺癌患者中表达上调[17]。但LINC00308对前列腺癌发展的功能作用尚需进一步研究。在本项研究中，观察到了与之前报道[7,17]相同的结果，LINC00308在33例前列腺癌组织中异常增加，这表明了LINC00308作为该疾病的致癌lncRNA的可能作用。为了确定LINC00308的详细功能，本实验利用小干扰RNA技术在前列腺癌细胞中干扰LINC00308的表达，发现转染si-LINC00308后，PC-3M和DU145细胞中LINC00308的表达水平被下调，说明成功构建干扰LINC00308表达的细胞。随后本实验对细胞的增殖、凋亡变化进行检测，结果显示，干扰LINC00308显著提高PC-3M和DU145细胞的G0-G1期细胞比例，降低S期细胞比例和增殖相关蛋白Ki67的表达，并且增加了细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase3表达水平，这表明干扰LINC00308的表达通过阻滞前列腺癌的细胞周期于G0-G1期来抑制癌细胞增殖，并促进细胞的凋亡，这意味着干扰LINC00308可以抑制前列腺癌的发展。

值得注意的是，miR-634已被鉴定为人类癌症中的肿瘤抑制因子[18]。胰腺癌组织和细胞系中的miR-634表达水平显著下调，miR-634在胰腺癌细胞中的异位过表达抑制了肿瘤的进展[19]。与正常脑组织相比，miR-634在神经胶质瘤组织中被下调，并且其表达与肿瘤大小和WHO分级相关[20]。miR-634通过靶向信号转导与转录因子3(Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)降低人乳腺癌细胞的放射抵抗力[21]。本实验利用脂质体用miR-634 mimic转染前列腺癌PC-3M和DU145细胞，结果表明，转染后miR-634 mimic的表达水平被上调，提示转染有效。继续探索miR-634在前列腺癌发生发展中的意义，结果发现miR-634的过表达可以增加PC-3M和DU145细胞的G0-G1期细胞比例、凋亡率和Caspase3蛋白水平，明显减少S期细胞比例和Ki67蛋白水平，这说明miR-634能够促进前列腺癌细胞G0-G1期阻滞，及诱导其凋亡，显示出一定的抗前列腺癌功能。

新兴证据表明，lncRNA通过海绵状miRNA充当竞争性内源RNA(ceRNA)[22-23]。例如lncRNA DANCR作为竞争性内源性RNA，通过在胶质瘤中海绵化miR-634来调节胶质瘤进展[24]。本研究通过生物信息学工具预测了与LINC00308具有互补碱基配对的miRNA，筛选出潜在的靶基因miR-634。在细胞功能测定中，检测到干扰LINC00308可以提高前列腺癌细胞内miR-634的表达水平。并且，双荧光素酶报告实验进一步证实了LINC00308对miR-634的靶向调控，这些结果说明miR-634是LINC00308的功能性靶基因，结合前述结果，提示干扰LINC00308抗前列腺癌的功能是通过上调miR-634的表达来实现的。

4 结论与启示

本研究显示，前列腺癌患者中LINC00308异常升高，而干扰LINC00308的表达抑制了前列腺癌细胞的增殖，并诱导了细胞的凋亡。另外，miR-634是介导上述LINC00308功能的相关miRNA，即干扰LINC00308通过促进miR-634的表达影响前列腺癌细胞增殖与凋亡。这一结果提示LINC00308可作为前列腺癌的潜在预后标志物和治疗靶标。