乳及乳制品中乳铁蛋白含量的电泳迁移率检测

黄锐，孙娜娜，张涵，杨孟迪，刘金虎，徐秦峰

(1.中垦华山牧乳业有限公司，陕西渭南714000；2.陕西科技大学食品与生物工程学院国家羊乳制品加工技术研发专业中心，西安710021)

0 引言

乳铁蛋白（Lactoferrin，简称Lf）是转铁蛋白家族中一种分子量为78 ku的非血红素铁结合糖蛋白，含有约690个氨基酸残基。乳铁蛋白是乳中至关重要的铁结合蛋白，主要存在于多种哺乳动物组织及外分泌液中，具有抵抗真菌和病菌感染、促进铁吸收、促成骨作用等多种生物活性功能[1-4]。并可通过调节活化先天免疫和适应性免疫的相关免疫细胞，使得促炎和抗炎细胞因子达到动态平衡，从而有效增强机体尤其是肠道的免疫功能[5]。

近年来，无论是城镇还是农村，随着人民生活水平提高，对于牛奶的品质要求也越来越高，“能喝到牛奶”的消费需求已是过去式，现如今“喝到好牛奶”才是消费者的真正诉求[6]。传统的常温奶采用超高温瞬时杀菌工艺，虽会显著延长牛奶的保质期，达到远距离运输的目的，但高温热处理会诱导乳蛋白的变性和聚集、乳糖异构化、造成维生素及营养物质的流失。近两年，由于巴氏鲜奶符合人们对于新鲜、营养、质优的追求而逐渐进入我国消费者视线，采用巴氏杀菌工艺，可在较低温度下杀死致病微生物，虽无法达到完全除菌效果，需要全程冷链运输，保质期仅有5～8 d，但却最大程度保留了牛奶中风味、营养及活性物质。所以巴氏奶才称得上是“鲜牛奶”而UHT常温奶只能称作“纯牛奶”[7]。

Sanchez[8]发现UHT（135℃处理4 s）超高温处理会严重破坏乳铁蛋白结构，使其无法结合细菌细胞壁上脂多糖，失去抗菌活性，而巴氏杀菌（72℃处理15 s）后holo-Lf和apo-Lf抗菌活性则未受到影响。研究表明[9-10]，由于乳铁蛋白铁结合能力易受到其热敏性影响，热变性程度随温度升高而逐渐增加，最终会对免疫活性等生理功能产生不可逆的影响。在保证优质奶源的前提下，最大程度保留牛乳中热敏蛋白活性的工艺显得尤为重要。因此，乳铁蛋白含量的测定对牛乳生产过程中热加工的风险评估和营养价值评定都具有重要的参考意义，确定最佳巴氏杀菌参数，是推进巴氏奶的必由之路，也将为中国优质乳工程的新未来指引方向。

目前常用的乳铁蛋白检测方法有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、SDS-PAGE、超高效液相-质谱联用法等。由于乳制品中成分的复杂性及乳铁蛋白含量占比较低，大多数高效液相色谱法[11-15]均需通过调节pH沉淀去除酪蛋白及肝素亲和柱的特异性吸附富集进行检测，成本较高。毛细管电泳法[16]虽然灵敏度和分辨率高，所需进样量少，但毛细管内壁需要进行涂层以抑制蛋白质吸附，重现性较差。表面等离子共振技术[17]无需进行放射性标记便可实时、自动检测婴儿配方奶粉中低含量的乳铁蛋白，但实验技术中温度及样品组成都会对结果产生影响，且仪器设备昂贵。超高效液相-质谱联用技术新颖、灵敏度高，但必须通过胰蛋白酶水解消化寻找特征片段作为信号分子[18]。李珊珊等通过SDS-PAGE法[19]实现乳铁蛋白的定量检测，准确度高、重现性好但凝胶染色脱色时间较长，其他蛋白会对实验结果有一定的干扰。酶联免疫夹心抗体法[20-22]灵敏度高但抗体制备复杂，试剂盒昂贵，进行测定时需要多次稀释才能保证读取有效的吸光度值，耗时较长。因此，如何确定乳铁蛋白含量的高效、准确、简便的测定方法仍是目前亟需解决的问题之一。

本文建立了一种基于凝胶电泳迁移率（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）原理的乳铁蛋白检测的方法，操作简单、检测成本低，对企业生产优质乳制品中乳铁蛋白的定量检测具有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Loading buffer（6×）以及DL500 bp DNA marker(Takara）,FAM-DNA序列(上海生工生物工程公司)，各蛋白标准品、100×TE缓冲液以及磷酸盐缓冲液PBS（Sigama-Aldrich），Sybr Gold染料(Invitrogen)，丙烯酰胺，过硫酸铵，TBE缓冲液。

5424R高速冷冻离心机，Eppendorf有限公司；垂直电泳仪，Bio-rad；DK-8D电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；MYSPIN12微型离心机，Thermo Fisher Scientific；凝胶成像系统，Bio-rad,Chemi-DocTMMP。

1.2 实验材料

液态奶样品购买于当地超市，转移至1.5 mL离心管，冰箱4℃储存待用。奶粉样品购买于当地超市，常温储存待用。

1.3 溶液配制

(1)DNA序列储备液：DNA引物3 000～4 000 r/min冷冻离心1min防止粉末飞散，按照管上提示在超净工作台中加入一定体积的1×TE缓冲液，涡旋振荡5 min充分溶解后3 000～4 000 r/min冷冻离心1 min落至管底，此时浓度为100μmol/L作为储备液置于冰箱4℃保存。

(2)PBS缓冲液(1×)：取一袋内容物溶于1 L蒸馏水或去离子水。25℃时pH为7.4，包含NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO4·12H2O 10 mmol/L,KH2PO42 mmol/L。

(3)蛋白标准品储备液(1 mg/mL)：称取各蛋白(乳铁蛋白Lf，酪蛋白Casein、乳球蛋白β-Lg、乳白蛋白α-Lac)标准品1 mg，1×PBS溶液溶解并定容至1 mL，各蛋白标准品储备溶液浓度为1 mg/mL。

(4)蛋白标准品使用液(100μg/mL)：将蛋白标准品储备溶液用1×PBS缓冲液稀释10倍，各蛋白溶液浓度为100μg/mL。

1.4 测定方法

1.4.1 DNA序列前处理

为了使DNA序列的构象更好的结合乳铁蛋白，进行退火处理。DNA序列储备液用1×的PBS稀释至1μmol/L，95±0.5℃加热5～10 min，冰箱-20℃下2 min冷却待用。

1.4.2 样品制备

5μL退火后的DNA序列加入Lf标准使用液或含乳铁蛋白的待测样品，加入1×的PBS至终体积为20μL，在37±0.5℃下孵育20 min。

液态乳样品混匀，生牛乳加样量0.5μL、巴氏乳加样量1μL、常温乳加样量3μL；奶粉样品称取1 g奶粉超纯水溶解至7 mL，加样量6μL。

1.4.3 电泳

(1)电泳：样品中混入6×Loading buffer（含溴酚蓝溶液）3μL。电泳参数：电压100 V，时间35 min，电泳缓冲液为1×TBE，胶浓度10%。为防止荧光降解，电泳过程应在避光条件下进行。

(2)10%PAGE配方：超纯水5.445 mL，5×TBE缓冲液2 mL，40%聚丙烯酰胺2.5 mL，10%过硫酸铵50μL，

TEMED 5μL。

1.4.4 凝胶成像以及数据采集

凝胶成像系统配套的分析软件Image lab进行数据分析，选择ALEXA488通道，获取电泳结果。点击“quantity Tools”读取各条带的荧光强度值。

1.5 特异性实验

前处理后的DNA序列5μL，分别加入乳铁蛋白以及酪蛋白、乳球蛋白、乳白蛋白使用液2.5μL，加1×PBS至终体积为20μL，混匀孵育。结果通过凝胶电泳结果以及采集复合物条带灰度值验证。

1.6 灵敏度实验

取5μL前处理后的DNA序列(1μmol/L)，分别加入乳铁蛋白标准品使用液0、1、2、3、4、5μL，加入1×PBS至终体系为20μL。离心，37±0.5℃孵育20 min。按照上述建立的方法采集复合物条带荧光灰度值，根据乳铁蛋白质量和复合物条带灰度值绘制乳铁蛋白检测的标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 可行性验证

EMSA是研究DNA分子和蛋白质相互作用的常用方法[23-25]。由于DNA-protein复合物和游离DNA的电泳迁移率差异，通过结合后在PAGE电泳图谱中观察到滞后条带，来判断特异性结合作用的发生[26]。乳铁蛋白等电点pI较高为8～9.5，其表面含有多个带正电荷的碱性区域，可以结合DNA、肝素等大分子物质[27]，部分研究筛选出和乳铁蛋白发生特异性结合的DNA序列片段[28-31]，本研究通过先前实验对比选取DNA序列[32](5’-(FAM)AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3’)作 为 探 针 分 子 结合Lf，由 于 该DNA序列能够特异性结合Lf而无法结合其他蛋白，从而实现乳铁蛋白和其他蛋白的有效分离，避免传统仪器检测复杂的前处理过程。

将乳铁蛋白和牛乳中的其他蛋白，如酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白以及结合缓冲液分别和FAM荧光标记的DNA序列孵育，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，验证方法的可行性。结果如图1所示，各泳道均可观察到游离的DNA序列条带，只有加入乳铁蛋白的泳道观察到了滞后的复合物条带。表明只有乳铁蛋白和DNA序列发生了特异性结合使得分子量增大，迁移速率较慢，同时游离的DNA泳带荧光亮度减弱。因此，可以通过DNA-Lf复合物条带荧光增强或者游离的DNA荧光减弱，实现乳铁蛋白的特异性定性检测。

2.2 灵敏度实验

为了验证所建立的PAGE法可以用于乳铁蛋白的定量检测，将不同浓度乳铁蛋白标准品分别和DNA序列孵育，结合缓冲液做空白对照，采集各复合物灰度值。结果如图2所示：随乳铁蛋白含量的增加，复合物条带的亮度不断增大，游离的DNA序列的亮度明显降低直至逐渐消失。采集各泳道复合物灰度值，以乳铁蛋白的质量(ng)为横坐标，Lf-DNA复合物的荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=-1606.47619+93.10857x，R2=0.9936。结果表明该方法用于乳铁蛋白的定量检测呈现良好的线性关系。

2.3 实际样品检测

图1 PAGE电泳检测乳铁蛋白的特异性

图2 不同浓度乳铁蛋白的电泳图及标准曲线图

为验证PAGE法可用于检测实际样品中乳铁蛋白含量，采用上述方法对市售的6种乳制品（生牛乳、巴氏杀菌乳、常温乳、阴性奶粉样品、两种阳性奶粉样品）简单稀释后，直接进行乳铁蛋白定量检测。并通过两种阳性奶粉样品的检测值和标示值进行对比，验证方法的准确性。添加乳铁蛋白标准溶液，测定回收率；对每种样品重复3次测定精密度。结果如表1所示。样品的加标回收率在70%～109%之间，生牛乳的乳铁蛋白检测量高于巴氏乳、常温乳，与预期相符。不同热加工工艺导致乳铁蛋白的热损失不同，证明本方法对于液态乳的热加工风险评估具有一定的参考意义。阳性奶粉检测值分别为29.42±0.025 mg/100 g(标示值为30 mg/100 g)以及46.18±0.01 mg/100 g(标示值为45mg/100 g)，与标示值接近，表明本研究仅需简单稀释、无需繁琐前处理就可实现乳制品中乳铁蛋白的定量检测。因此，本方法可为企业优质乳的生产过程监管以及奶粉的营养价值评估提供一定的技术支持。

表1 实际样品检测结果

图3 实际样品检测电泳图

3 结论

婴幼儿奶粉中添加乳铁蛋白使其母乳化，增强婴儿免疫力，但乳铁蛋白的过量添加会对婴儿的肝肾功能造成负担；液态乳热处理工艺的不同，天然功能性乳铁蛋白的保留程度不同[33]。因此，乳铁蛋白含量的测定对牛乳生产过程中过热加工的风险评估和婴幼儿配方奶粉的营养价值评定都具有重要的参考意义。由于乳制品样品基质的复杂性，乳铁蛋白丰度较低目前国内外仍然没有标准的检测方法。本研究通过DNA序列和乳铁蛋白的特异性结合，避免了传统仪器检测乳铁蛋白繁琐的前处理过程。基于游离DNA序列和Lf-DNA复合物的凝胶电泳迁移率差异通过复合物的荧光强度值和乳铁蛋白浓度呈现的良好线性关系建立了一种低成本、易操作、高效的生牛乳等乳制品中乳铁蛋白的PAGE电泳定性、定量检测方法。对液态乳的热加工工艺的控制以及奶粉的营养价值评估均具有重要意义。