肝癌细胞外泌体的摄取与作用研究

李 佳，王淑芳，蔡晓谕，曹俊宁，李小飞，黄远帅，汪德清

0 引 言

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤，具有高死亡率和易复发的特点。在肿瘤发生发展过程中，外泌体介导的具有生物学活性的RNA、miRNA及蛋白质等在细胞间转移可改变肿瘤微环境[1]。肝细胞癌新生血管丰富，易发生侵袭和转移[2]，肝癌外泌体可通过新生血管促进肝癌局部扩散和多灶性生长[3]。肝癌细胞外泌体有助于肝癌细胞增殖[4]及耐药性产生[5]。特定的外泌体在不同器官中积累可使其与某些类型细胞发生相互作用，黑色素瘤外泌体能在肺、骨、肝和脾中积累并增加这些部位的转移率，提示外泌体的特异靶向性能促进其发挥生理功能[6]。受体细胞通过摄取外泌体获得供体细胞生物学信息，完成细胞间信息交换。对化疗药物敏感的肝癌细胞摄入耐药肝癌细胞产生的含有P-糖蛋白外泌体产生耐药性[7]。肝内皮细胞摄入肝癌细胞分泌的含有血管紧张素外泌体后可促进肝癌向周围组织迁移[8]。

不同类型受体细胞摄取外泌体的机制存在差异[9]，目前不同类型细胞对同一种外泌体摄取差异性比较的报道尚不多见。为进一步明确肝癌细胞外泌体的信息转运机制和生物学功能，本研究旨在研究不同类型细胞摄取肝癌外泌体的差异和肝癌外泌体能否影响其增殖能力，以及肝癌细胞外泌体能否对肝细胞产生作用，为后续研究外泌体对肝癌的侵袭转移作用途径及肝癌细胞外泌体相关生理功能提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料超高速离心机(Thermo Scientific，美国)；透射电镜(JEOL，日本)；全能型化学发光成像系统(BIO RAD，美国)；荧光共聚焦显微镜(Leica，美国)；全自动酶标仪(Thermo Scientific，美国)；BCA定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、ECL化学发光液(Solarbio，中国)；Tsg101单克隆抗体(Bioworld，美国)、CD63单克隆抗体(Abcam，英国)、羊抗小鼠IgG(Solarbio，中国)；DIO染料(invitrogen，美国)；DMEM培养基、RPMI-1640培养基(Hyclone，美国)；CCK-8试剂(同仁,日本)；EASY-nLC 1000 液相色谱、Thermo Q Exactive HF质谱仪(Thermo，美国)；色谱仪器(岛津，日本)。

1.2实验方法

1.2.1 细胞培养红细胞来源于解放军总医院第一医学中心输血科健康献血志愿者；HepG2细胞、SMMC7721细胞受赠于解放军总医院第五医学中心；K562细胞受赠于中科院；肝细胞受赠于中国人民解放军总医院第一医学中心肝胆外科。细胞均于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2.2无外泌体FBS制备将普通FBS于10 000×g、4 ℃离心2 h后，取上清在110 000×g、离心半径11.95 cm、4 ℃离心8 h，上清用0.22 μm滤膜过滤后得到无外泌体FBS[11]。

1.2.3外泌体提取收集培养48 h的HepG2细胞培养液上清，在2000×g、4 ℃离心30 min，取上清在10 000×g、离心半径13.5 cm，4 ℃离心30 min，留上清在110 000×g、离心半径11.95 cm，4 ℃离心90 min，弃上清，PBS重悬沉淀，经0.22 μm滤膜过滤后再次用110 000×g、离心半径11.95 cm，4 ℃离心90 min，弃上清，用PBS重悬管底HepG2细胞外泌体[9]。

1.3外泌体鉴定

1.3.1 透射电镜检测外泌体形态和大小取外泌体PBS悬液20 μL滴于塑料薄膜上，将铜网倒扣于悬液表面，室温放置10 min后用滤纸吸干液体，用1%戊二醛固定外泌体并用双蒸水洗涤铜网两次，充分干燥铜网后，将铜网放置于样品杆上样区，并在-80 kV透射电镜下进行观察。

1.3.2Westernblot验证BCA法测定外泌体蛋白浓度，将外泌体蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭，加入HSP70(1∶1000)单克隆抗体、Tsg101(1∶1000)单克隆抗体、β-actin单克隆抗体(1∶1000)4 ℃过夜孵育，室温摇床孵育二抗90 min。在膜上滴加适量ECL化学发光液，通过全能型化学发光成像系统分析。

1.4外泌体荧光标记在肝癌外泌体悬液中加入DIO染料，避光，室温孵育20 min；110 000×g、4 ℃超离90 min，弃上清，用PBS重悬经0.22 μm滤膜过滤；再次超离，弃上清，PBS重悬外泌体[9]。

1.5外泌体与细胞共培养将DIO标记外泌体与红细胞(107/mL)、K562细胞(106/mL)、HepG2细胞(106/mL)和SMMC7721细胞(106/mL)共孵育24 h；PBS洗涤细胞2次后用培养基重悬细胞；利用共聚焦显微镜(激发光484 nm)进行观察[12]。

1.6细胞增殖检测在96孔板中加入100 μL的细胞悬液(5×103/孔)，预培养24 h；加入0.1 μg/μL肝癌细胞外泌体20 μL后孵育24 h；加入CCK-8溶液，孵育1 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，实验重复3次。

1.7肝细胞蛋白质谱检测外泌体共培养组：与HepG2外泌体共培养后的肝细胞(hep_ev)，取30 μg外泌体与1×106个肝细胞共培养48 h；对照组：加入等体积PBS的肝细胞(hep)，运用非标记定量蛋白质谱检测样本肝癌相关蛋白表达水平，蛋白鉴定使用Precursor Qvalue Cutoff 0.01, Protein Qvalue Cutoff 0.01,P值校正Kernel Density Estimator；蛋白定量使用子离子峰面积，至少选择3个子离子的平均强度定量；蛋白差异分析使用Students t-test；蛋白质功能分析基于GO，KEGG等数据库进行分析。

2 结 果

2.1 肝癌细胞外泌体提取与鉴定肝癌细胞外泌体为40～150nm的盘状囊泡样结构，肝癌外泌体可表达常见的外泌体表面抗体HSP70和Tsg101，见图1。

a：电镜；b：Western blot

2.2不同细胞摄取肝癌外泌体的差异HepG2 EVs示踪显示，HepG2细胞和SMMC7721细胞内的荧光信号较强。K562细胞中可观察到荧光信号(148.50±8.50)，较HepG2和SMMC7721(206.76±3.93、214.02±2.45)弱。红细胞内无荧光信号。见图2。

2.3肝癌细胞外泌体对HepG2细胞、SMMC7721细胞、K562细胞增殖的影响外泌体共培养组、对照组对HepG2细胞、SMMC7721细胞、K562细胞的增殖无明显差异(P>0.05)。见表1。

a:HepG2细胞;b:SMMC7721细胞;c:K562细胞;d:RBC

表 1 肝癌细胞外泌体对3种肿瘤细胞增殖的影响

2.4肝癌细胞外泌体对肝细胞的作用与肝癌外泌体共培养后的肝细胞有42种蛋白表达存在差异，其中27种蛋白表达上调，15种蛋白表达下调，PPIA、PSMA1、PARK7、PNP、UBA1、CYCS、TXNRD2、USP5等差异蛋白与肝癌发生发展有关；TPI1、ALDH1B1和糖酵解有关。GO分析提示上调蛋白的细胞定位包括细胞外囊泡、细胞外部分、囊泡等。生物学过程主要包括有机氮化合物代谢过程、有机酸代谢过程、小分子代谢过程、药物代谢过程、对化学物质的反应等。KEGG通路分析提示差异蛋白主要参与代谢途径、氨基酸合成、糖酵解途径、蛋白酶体等。见图3。

a：差异蛋白火山图；b：上调蛋白定位GO分析；c：上调蛋白通路GO分析；d：差异蛋白KEGG富集分析

3 讨 论

细胞通过多种内吞方式摄取外泌体，包括依赖网格蛋白的内吞作用、不依赖网格蛋白的内吞作用[13]、小窝蛋白调节的内吞作用和依赖小窝蛋白/脂质筏途径的内化作用等[14]。本研究发现在相同的温度和培养时间内，HepG2细胞和SMMC7721细胞摄入肝癌外泌体的量大于K562细胞，且成熟红细胞不摄入肝癌外泌体，可能与外泌体来源、细胞与外泌体表面受体配体匹配程度、不同外泌体摄取机制有关。胰腺癌血管内皮外泌体可被腹腔渗出细胞大量摄取，而被粒细胞和T细胞摄取量较少；淋巴结间质细胞的Tspan8外泌体能被内皮细胞、胰腺细胞大量摄取，而被亲代淋巴结间质细胞摄取较少[15]，提示细胞对外泌体的摄取能力存在一定的特异性。

在肿瘤的发生发展中，肿瘤外泌体可调节肿瘤微环境，加快疾病晚期进程[16]。肝癌细胞外泌体介导的细胞通讯可促进肝细胞癌发生浸润转移[17]。肝癌的血管蛋白外泌体可增加肿瘤细胞与内皮细胞之间的信息交换，促进肝癌的侵袭和转移[8]。肝癌细胞CD147外泌体使肝基质中的成纤维细胞产生更多的MMP-2，增强肝癌细胞侵袭和迁移的能力[18]。高转移性MHCC97H细胞的外泌体进入低转移性肝癌细胞可增强受体肝癌细胞的侵袭和转移[19]。本研究表明肝癌细胞外泌体对HepG2细胞、SMMC7721细胞、K562细胞的增殖能力无明显影响，需进一步明确肝癌细胞外泌体在肝癌转移过程中作用和相关机制。

肝癌外泌体可改变肝细胞多个代谢过程。其中，有机氮化合物代谢过程、小分子代谢过程、药物代谢过程、对化学物质的反应增加，肝细胞的催化活性、蛋白结合、药物结合、RNA结合等增强。在表达上调的蛋白中，UBA1参与泛素介导的蛋白水解，其在肝癌组织中表达量高于非肿瘤组织，被认为可能与肝癌的发生有关[20]；PSMA1是蛋白酶体的一个亚基，蛋白酶体途径可调节广泛的细胞过程，如细胞周期、细胞分化、基因转录控制、DNA修复、细胞死亡等。肝癌细胞的PSMA1 mRNA低于正常细胞，PSMA1可能与肝癌发生发展有关[21]；PPIA参与肿瘤的增殖和肿瘤细胞迁移，肝癌患者PPIA过表达与肿瘤大小相关，敲低该蛋白可使肝癌细胞对阿霉素敏感[22]；PNP可将腺苷类似物转化为高毒性代谢物，干扰DNA、RNA和蛋白质合成，PNP/氟达拉滨可诱导肝癌细胞死亡，发挥抗肿瘤作用[23]；CYCS参与凋亡、乙型肝炎、丙型肝炎、p53信号通路等，肝癌患者血清的CYCS高于慢性肝炎患者，可能与肝癌发生过程中肝细胞死亡数量增加有关[24]；PARK7为致癌基因，PARK7在肝癌细胞系 MHCC-97L中过表达可通过MAPKs和AKT信号通路诱导癌细胞增殖[25]。USP5表达下调，Usp5过表达可促进肝癌细胞集落形成、迁移、耐药和肿瘤发生[26]。

综上，不同种类细胞对肝癌外泌体摄取量的差异可能与不同的内化机制有关，需要进一步研究。在肝癌发生发展中，肝癌细胞外泌体可影响正常肝细胞的代谢和肝癌相关蛋白表达水平，发挥外泌体的促进肿瘤发展和侵袭的生物学功能。