二甲双胍调控TGF-β1/Smad信号通路治疗宫腔粘连的机制研究

丁 涛，江 梅，邵 帅，姜经航

0 引 言

宫腔粘连又被称为Asherman综合征，病理学认为子宫内膜纤维化参与宫腔粘连形成，有效降低子宫内膜纤维化程度，可能有助于治疗宫腔粘连的形成[1-3]，进而为因宫腔粘连导致不孕的患者带来福音。有研究指出二甲双胍能够通过抑制转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、 Smad2/3和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号分子，从而抑制组织器官的纤维化以及肿瘤细胞的上皮间质转化[4]，使用二甲双胍能够抑制TGF-β1/Smad3信号通路改善肝纤维化程度[5]。同时在放射性肺炎中使用二甲双胍，抑制Smad2/3磷酸化降低肺纤维化[6]。同时有研究表明，在动物宫腔粘连模型中，TGF-β1参与宫腔粘连的形成[7]。但是目前关于二甲双胍用于预防和治疗宫腔粘连的研究较少。因此本研究通过对构建成功的宫腔粘连大鼠模型给予二甲双胍处理，探讨其对逆转子宫内膜纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料6～8周性成熟雌性大鼠40只，体重150～200 g；9～10周性成熟雄性大鼠20只，体重400～530 g。动物许可证号：SCXK2015-0018。普通级别，自然光线，24 h明暗交替，室温24～26 ℃，定期消毒。TGF-β1抗体、Smad-3抗体、MMP9抗体、Fibronectin抗体以及a-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, a-SMA)抗体购于英国abcam公司，Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，SYBR©Premix、逆转录试剂盒以及TGF-β1、Smad-3、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、纤维粘连蛋白以及a-SMA基因引物购于日本公司大连Takara分公司。TGF-β1引物序列为上游: ATTCCTGGCGTTACCTTGG，下游: AGCCCTGTATTCCGTCTCCT；Smad3引物序列为上游: CGACCACCAGATGAACCACA，下游:GCTGTGAAGCGTGGAATGTCT；MMP9引物序列为上游: TTGACAGCGACAAGAAGTGG，下游:GCCATTCACGTCGTCCTTAT；Fibronectin引物序列为上游: TTGAGGAACATGGCTTTAGGC，下游: CTGGGAACATGACCGATTTG；a-SMA引物序列为上游: CCGAATGCAGAAGGAGATCA，下游: GTGGACAGAGAGGCCAGGAT；GAPDH引物序列为上游: CTGGGCTACACTGAGCACC，下游: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG。

1.2实验方法

1.2.1 实验分组成功构建大鼠宫腔粘连动物模型[9]。对照组：双侧子宫未行处理，未行二甲双胍处理；建模组：刮宫联合感染法构建宫腔粘连模型，未行二甲双胍处理；二甲双胍灌胃组：刮宫联合感染法构建宫腔粘连模型，行二甲双胍灌胃[300 mg/(kg·day)]，连续服用4周；二甲双胍宫腔灌注组：刮宫联合感染法构建宫腔粘连模型，行二甲双胍宫腔灌注[300 mg/(kg·day)]，隔日一次，连续使用4周。每组10只。

1.2.2大鼠处理4周后1%戊巴比妥纳(5 mL/kg)麻醉，每组颈椎快速脱臼处死大鼠5只。切开下腹部，暴露子宫并切除。子宫组织液氮冷冻。每组剩余5只雌性大鼠和雄性大鼠按照1∶1比例合笼，次日早晨检查阴道栓，有阴道栓为交配成功，计为妊娠0.5 d。13.5 d后处死大鼠，记录和评估每组双侧子宫孕囊数。

1.2.3荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad3、MMP9、Fibronectin以及a-SMA mRNA的表达按照TRIZOL试剂提供说明书进行总RNA提取。RNA的纯度和浓度使用紫外分光光度法测定；RNA的完整性使用琼脂糖凝胶电泳鉴定。RNA逆转录cDNA以及PCR反应体系、反应条件均按照Takara公司提供的荧光定量PCR检测试剂盒提供操作流程进行。实验重复3次。

1.2.4Western blot检测TGF-β1、Smad3、MMP9、Fibronectin以及a-SMA 蛋白质的表达待检测的组织在液氮中研磨，用含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解，蛋白含量通过DC蛋白鉴定试剂盒测定，相同蛋白浓度的裂解液经煮沸5 min后，通过PAGE分离，然后转膜到纤维尼纶膜上。阻断非特异的结合位点后，用相应的抗体在4 ℃孵育过夜，洗膜后用过氧化物酶连接的二抗孵育后，用增强化学发光发(enhanced chemiluminescence, ECL)显示蛋白带，然后测量其密度。实验重复3次。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad3、MMP9、Fibronectin以及a-SMA mRNA的表达建模组TGF-β1、Smad3、Fibronectin及a-SMA 的mRNA较对照组、二甲双胍灌胃组明显上调，MMP9 mRNA明显下降(P<0.001)。二甲双胍宫腔灌注组中TGF-β1、Smad3、Fibronectin及a-SMA的 mRNA表达较二甲双胍灌胃组明显下降，MMP9mRNA表达明显上调(P<0.05)。见表1。

2.2Western blot检测TGF-β1、Smad3、MMP9、Fibronectin以及a-SMA 蛋白质的表达建模组TGF-β1、Smad3、Fibronectin及a-SMA 的蛋白表达较对照组、二甲双胍灌胃组明显上调，MMP9蛋白表达明显下调(P<0.001)。二甲双胍宫腔灌注组TGF-β1和a-SMA的蛋白表达较二甲双胍灌胃组明显下调，MMP9蛋白明显上调(P<0.001)。见表2，图1。

2.3各组大鼠生育能力的比较对照组、建模组、二甲双胍灌胃组及二甲双胍宫腔灌注组宫腔中孕囊数分别为(11.0±1.6)个、(3.2±0.8)个、(6.6±1.1)个以及(8.2±0.8)个，两两组间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。

表 1 各组大鼠子宫内膜相关信号分子mRNA的表达量

表 2 各组大鼠子宫内膜相关信号分子蛋白的表达

3 讨 论

IUA 主要以手术治疗为主，但术后辅以药物治疗效果不佳，并且IUA术后再次发生粘连的机率为3.1%-23.5%，特别是重度IUA复发率可超过60%[8]，IUA妊娠情况改善不明显。研究显示子宫内膜成纤维细胞分泌大量的细胞外基质，导致子宫内膜纤维化，内膜纤维化替代正常子宫内膜，致使宫腔局部或广范粘连[9]。

二甲双胍是治疗2型糖尿病患者的一线用药，除了降糖作用外，还具有抗炎、抗纤维化、抗氧化应激等生物学作用[10]。近年来关于糖尿病与肝纤维化关系的研究中, 已有证据显示糖尿病是肝纤维化发生的一个重要危险因素[11]。二甲双胍在降低血糖的同时也能够发挥抗纤维化作用，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中发现二甲双胍能够通过抑制TGF-β1和Smad3 信号通路降低肝脏纤维化程度[12]；二甲双胍可以通过激活AMPK信号通路以及抑制succinate-GPR91 信号通路来减弱激活肝星状细胞从而降低肝脏纤维化程度[13]；除此之外，二甲双胍能够通过 PIK3r1来调控FOXO3的表达来抑制辐射诱导的皮肤纤维化[14]；二甲双胍能够明显降低胶原蛋白1a和TGF-β1的表达，抑制Smad2/3磷酸化的表达，从而减少了放射性肺炎导致的肺纤维化[6]。

TGF-β1是目前所引起器官纤维化最重要的细胞因子之一，其中通过活化Smad信号通路发挥生物学作用[15, 16]。在 TGF-β1/Smad通路中，TGF与相应细胞膜受体结合后诱导 Samd2/3发生磷酸化，而后与Smad4结合形成共同复合物，从而促进各型胶原蛋白，纤维粘连蛋白等的表达，导致细胞外基质堆积增多，加速纤维化形成[17]。目前有研究表明TGF-β1在肝脏、肺以及肾脏纤维化中起着关键性作用[18]，但是其在宫腔粘连纤维化作用机制的报道尚少，目前有报道指出TGF-β1、Smad3和Smad7信号分子在兔宫腔粘连动物模型以及IUA病人血液中都出现异常表达，并且动物模型用使用Smad3抑制剂能够下调TGF-β1、Smad3和上调Smad7，从而抑制宫腔纤维化发生，降低宫腔粘连[19]。成纤维细胞表面自身受体结合TGF-β1后，能够使TGF-β1/Smad信号通路被激活，进一步上调细胞外基质蛋白和a-SMA，促进纤维化形成[19]。对小鼠子宫内膜基质细胞进行TGF-β1处理，可以发现其可以调控MMP9的表达，促使胶原蛋白降解，减少细胞外基质的沉积，减轻纤维化程度[21]。在MMP9缺陷的小鼠成纤维细胞过表达MMP9以后发现，能够降低TGF-β1活性以及由其驱动的各种反应，从而在纤维化形成中发挥着重要作用[22]。在肾小球肾炎以及肾脏硬化模型中，使用无高糖诱导剂可以发现，TGF-β1可表现剂量以及浓度依赖调节Fibronectin的表达[23]。色素性以及假性剥脱性青光眼与细胞外基质重塑有关，在对其研究发现TGF-β1能够调控Fibronectin发挥促进纤维化的作用[24]。在本研究中，相对于对照组，建模组以及二甲双胍处理中TGF-β1表达均上调，同时其下游基因Smad3也出现上调，促进细胞外基质降解的MMP9却表达下调，并且纤维化有关指标Fibronectin以及a-SMA也相对出现下调。

本研究中，我们将二甲双胍用于宫腔粘连的大鼠模型治疗，从中可以发现二甲双胍能够使得上调的TGF-β1出现下调，并且子宫内膜局部用药在逆转TGF-β1中表现更加明显。并且其下游靶基因Smad3无论在基因水平还是蛋白水平均表现为高表达向低表达逆转，但是并不能完全逆转。同时二甲双胍更够促进下调的MMP9逐渐上调，并且纤维化有关指标Fibronectin以及a-SMA也表现为上调变为下调，但是不能使其回复至正常水平。我们进一步考虑二甲双胍对IUA大鼠生育能力影响，将各组与雄性大鼠合笼后检测宫腔内孕囊数发现，对照组、建模组、二甲双胍灌胃组以及二甲双胍宫腔灌注组宫腔中孕囊数分别为(11.0±1.6)个、(3.2±0.8)个、(6.6±1.1)个以及(8.2±0.8)个，差异有统计学意义(P<0.001)。二甲双胍使用以后能够改善其生育能力，并且在局部用药中表现更加明显。

综上所述，二甲双胍能够靶向调控TGF-β1/ Smad信号通路进而逆转IUA大鼠的宫腔粘连，改善宫腔粘连大鼠生育能力，并且宫腔灌注局部用药效果最佳。对于宫腔粘连的病人，在实施宫腔粘连手术后宫腔使用二甲双胍有可能效降低子宫内膜纤维化程度，预防宫腔粘连的形成，进而为因宫腔粘连导致不孕患者带来福音。