Slit2 在膀胱癌中的表达、信号通路及其与患者预后关系的生物信息分析

李 扬，王 云，李 遵，朱朝阳

河南大学淮河医院 泌尿外科，河南 开封475000

膀胱癌是临床上较为常见的一类泌尿上皮性肿瘤。相关流行病学研究显示，全球范围每年膀胱癌新发病例高达45 万，因膀胱癌死亡的患者超过15万［1］。因此，膀胱癌已成为肿瘤致死的重要原因之一。然而，膀胱癌确切发病的分子机制仍不十分清楚［2］，且部分患者术后常常多次复发，是导致治疗失败和患者死亡的重要原因。因此，在分子机制上探讨膀胱癌发生、复发转移和预后分子标志物是目前的研究热点［3-4］。

Slit2 基因定位于人4 号染色体，既往研究认为其在神经发育中发挥重要作用。近年来研究［5-8］显示，Slit2 在多种实体肿瘤中呈现差异表达，并与其生物学行为如侵袭转移能力增强有关。Slit2 在人膀胱癌中的研究报道不多。因此，本研究采用生物信息学方法探讨Slit2 基因在膀胱癌中的表达情况及其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 Slit2 表达水平分析

采用生物信息学方法首先在GTEx（https：／ ／www.gtexportal.org／home／）数据库中检索slit2 基因在人体各种组织中的表达水平。在TCGA 数据库（https：／ ／portal.gdc.cancer.gov／）中分析Slit2多种肿瘤组织及在膀胱癌中的表达。采用TCGA数据库在线分析软件GEPIA（http：／ ／gepia.cancer-pku.cn／detail.php）比较膀胱癌患者癌组织和癌旁组织中slit2 基因mRNA 表达水平及其与患者临床分期的关系。

1.2 Slit2 突变分析

在用 TCGA 在线分析工具 cBioPortal（http：／ ／www.cbioportal.org／）对Robo1 的 在 膀胱癌及多种实体肿瘤中的突变情况进行分析。包括突变种类、突变频率及对应的突变位置。同 时，在COSMIC（https：／ ／cancer.sanger.ac.uk／cosmic／）数据库中分析突变频率、单核苷酸突变位点及频率。

1.3 Slit2 相关基因蛋白网络构建及KEGG 信号通路分析

在STRING 数据库中，构建Slit2 相关基因表达的蛋白-蛋白相互作用网络。构建条件为：相互作用来源为实验、共表达、数据库、基因融合等；最小相互作用评分为0.07，相互作用蛋白不超过20 个。同时在KEGG 数据库中（https：／ ／www.genome.jp／kegg／pathway.html），对相互左右的蛋白网络进行信号通路富集。

1.4 Slit2 表达与患者预后

根据Slit2 表达水平，分为高低表达组（高表达组：Slit2 基因mRNA 表达水平＞＝肿瘤组织中的中未表达数；低表达组：Slit2 基因mRNA 表达水平＜肿瘤组织中的中未表达数），比较两组患者无疾病进展生存（DFS）和总生存（OS）是否存在差异。高低表达组生存比较采用log-rank 建议。

1.5 统计分析

数据分析采用STATA12.0 软件完成，相关基因表达、预后、突变等分析采用在线数据分析工具，双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Slit2 表达水平分析

Slit2 基因mRNA 在人体各个组织中表达水平存在差异，且组织间表达水平变异程度较大，见图1A。TCGA 数据库中，Slit2 基因mRNA 在膀胱癌患者癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常膀胱组织（P＜0.05），见图1B；且Slit2 表达水平与患者临床分期有关，分期越高表达水平越高（P＜0.05），见图1C。

2.2 Slit2 突变水平分析

Slit2 基因主要突变形式为融合突变、扩增突变、深度缺失突变和多重突变等，见图2A。具体突变位置，见图2B。其中缺失突变占25.55%，同义突变占8.19%，无意义突变占2.01%，见图3A。单核苷酸突变主要类型为C＞T（28.51%）、G＞T（13.64%）和C＞A（9.85%），见图3B。

图1 Slit2 基因mRNA 表达水平分析（A：Slit2 基因在多种组织中表达；B：Slit2 基因在膀胱癌及其癌旁组织中表达；C：R Slit2 基因表达与膀胱癌分期）

2.3 Slit2 相关基因蛋白网络及信号通路富集

STRING 数据库中构建Slit2 相关基因蛋白网络，网络中共有21 个相关基因，基因间的联系为92，平均节点相关度为8.76，区域聚类指数为0.776，相关蛋白网络富集明显（P＜0.001），见图4。蛋白网络相关基因KEGG 信号通路主要富集于Ras 信号通路、T 细胞受体信号通路、Rap1 信号通路和ErbB 信号通路等，见表1。

2.4 Slit2 表达与患者预后

Slit2 高低表达膀胱癌患者无疾病进展生存（DFS）和总生存（OS）间均存在明显的差异（P＜0.05）。DFS（HR ＝1.5，P＝0.026）和OS（HR ＝1.50，P＝0.015）在Slit2 高表达组患者显著低于低表达组，提示Slit2 高表达是膀胱癌预后不良的因素，见图5。

3 讨论

Slit 基因于1984 年被Jürgens 等首次于果蝇胚体中发现，并发现其能够对果蝇幼体角色泽起到作用。1988 年Rothberg 等［9］报道Slit 蛋白可以在果蝇中枢神经中线胶质细胞中合成，Slit 蛋白减少可导致联合（交叉）神经元轴突和纵行传导通路在中线的聚集出现异常。Slit 蛋白在哺乳动物体内主要由3 个成员组成，分别为Slit1、Slit2 和Slit3，三种蛋白均可于神经系统中线表达，也可于其他细胞类型中表达［10-12］。近年来，陆续有研究报道Slit2 在多种人实体肿瘤组织中的表达水平明显高于对应的癌旁组织，提示Slit2 在肿瘤的发生发展中可能发发挥重要作用［13-17］。

图2 Slit2 基因突变水平分析（A：Slit2 基因主要突变形式；B：Slit2 基因突变位置）

图3 Slit2 基因突变频率分析（A：各种突变频率；B：单核苷酸突变频率）

图4 Slit2 基因相互作用蛋白网络图

表1 Slit2 相关基因蛋白网络KEGG 信号通路富集

图5 Slit2 基因表达与膀胱癌患者生存期分析（A：高低表达患者无疾病进展生存比较；B：高低表达患者总生存比较）

然而，关于Slit2 在膀胱癌中的表达及其与患者预后关系的研究报道多，其在膀胱癌中的生物学行为及作为预后分子标志物的可行性亦不明确。因此，我们采用生物信息学的方法探讨Slit2 在膀胱癌中的表达情况、相关信号通路及其与患者预后关系。研究结果显示，Slit2 基因mRNA 在膀胱癌患者癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常膀胱组织（P＜0.05），且Slit2 表达水平与患者临床分期有关。分期越高表达水平越高（P＜0.05），说明Slit2 可能起促癌作用，在膀胱癌的发生中发挥重要作用。进一步分析显示，Slit2 基因主要突变形式为融合突变、扩增突变、深度缺失突变和多重突变等。其中缺失突变占25.55%，同义突变占8.19%，无意义突变占2.01%。上述突变的存在可能进一步影响基因表达产物水平，从而引发肿瘤的发生。Slit2 相关基因KEGG 信号通路主要富集于Ras 信号通路、T 细胞受体信号通路、Rap1 信号通路和ErbB 信号通路等。上述小信号通路大多与肿瘤的发生、发展及生物学行为有关。预后分析显示，Slit2 高低表达膀胱癌患者DFS 和OS 间均存在明显的差异（P＜0.05）。在Slit2 高表达组患者显著低于低表达组，提示Slit2 高表达是膀胱癌预后不良的因素。

因此，Slit2 基因在膀胱癌患者癌组织中表达水平明显上调，高表达与膀胱癌患者的预后不良有关。但研究本身单纯从生物信息分析水平证实了Slit2在膀胱癌组织中存在差异表达，并与预后有关，但其结论有待进一步相关体内外实验证实。