基于数据挖掘分析HOXA3在急性髓系白血病中的表达及意义

张 媛，吴 隼，郭 燕，王莉华，刘宪凯，黄 琰

新乡医学院第一附属医院 血液内科，河南 卫辉453100

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）的侵袭性克隆性疾病，HSPCs 获得突变后，导致骨髓分化受阻，产生具有自我更新能力的白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs），从而抑制正常的造血分化，引起贫血、出血、感染等一系列相关症状［1］。尽管随着AML 相关的分子机制逐渐被发现，患者的生存时间和治愈率得到了很大的提高，但仍然有近60%的患者会在2～3 a 后复发［2］，因此，进一步探索与AML 发生、发展相关的分子机制及其治疗靶点具有重要意义［3］。

研究发现同源盒基因（homebox，HOX）家族是正常和恶性造血的重要调控因子［4］。HOX 基因家族是高度保守的转录因子，由A、B、C、D 四个亚族组成，每个亚族又包含9～11 个不同的基因［5］。HOXA5、HOXA9、HOXA13 等基因在白血病发生、发展中的作用已经有了相关研究，但HOXA3 在白血病中的作用及临床意义仍没有相关的阐述。

本研究基于生物信息学，利用Oncomine、TCGA、String-DB、DAVID等数据库探索AML中HOXA3 蛋白表达差异及其相互作用的蛋白，并研究其与AML 预后的关联。

1 资料与方法

1.1 Oncomine v4.5 数据库提取数据

Oncomine 数据库（https：／ ／www.oncomine.org／resource／main.html）是癌症基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，可以根据实际需要设定筛选条件，进行癌症与正常组织、癌症不同病理类型、癌症与药物治疗敏感性的差异性分析。本研究搜索设置条件为：①Gene：HOXA3；②Cancer Type：Leukemia；③Data Type：mRNA；④临界值设定条件（P value ＜0.001，fold change1.5，gene rank ＝Top 10%）。

1.2 String-DB v11.0 数据库

String-DB 数据库［6］（https：／ ／string-db.org／）是研究基因和蛋白之间相互作用关系的平台，其中包含已证实的和可预测的蛋白-蛋白相互作用数据库。本研究检索设定：HOXA3；Homo sapiens；medium confidence（0.400）；No more than 50 interactors。

1.3 DAVID v6.8 数据库

将String-DB 数据库筛选出的与HOXA3 相互作用的50 个基因，使用DAVID［7］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）进行GO 富集和KEGG 通路分析，下载相关数据分析作图，获取与HOXA3 相互作用的基因改变的信号通路。

1.4 TCGA 数据库

从TCGA数据库（https：／ ／www.cancer.gov／about-nci／organization／ccg／research／structural-genomics／tcga）中下载LAML 相关的数据，使用R 3.6.3 软件处理LAML 的数据，进行HOXA3 相对表达量的分析，并下载LAML 的临床数据，将生存数据和HOXA3 的表达数据合并，用Survival 包进行作图和统计学检验。

1.5 细胞培养

kasumi-1（M2）、NB4（M3）、HL60（M3）、THP1（M5）、U937（M5）和TF-1（M6）六种白血病细胞由新乡医学院保存。细胞培养均用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基，培养箱条件为37 ℃、5% CO2恒温加湿。

1.6 Real-time PCR 检测HOXA3 的mRNA 表达水平

收集各组细胞，利用TRIzol 提取总RNA。按照诺唯赞公司的反转录试剂说明书进行逆转录，将cDNA 置于-80 ℃保存备用。采用SYBR Green 法进行PCR。所涉及的引物序列为：HOXA3-F：5′-ATGCAAAAAGCGACCTACTACG-3′；HOXA3-R：5′-TACGGCTGCTGATTGGCATTA-3′；GAPDH-F：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；GAPDH-R：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.7 统计学分析

采用SPSS 和R 软件进行相关的统计分析，以P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXA3 在不同肿瘤类型中的表达

在Oncomine 数据库检索HOXA3，共有519 个有关的研究结果，其中HOXA3 表达有统计学差异的研究结果共28 个，HOXA3 表达增高的研究有14个，表达降低的研究有14 个，见图1。在血液恶性肿瘤中，白血病中高表达的研究有3 个，淋巴瘤中高表达的研究有1 个，骨髓瘤中低表达的研究有1 个（临界值设定条件：P value＜0.001，fold change 1.5，gene rank ＝Top 10%）。

图1 Oncomine 数据库中HOXA3在各种肿瘤组织中的表达情况

2.2 HOXA3 在白血病中的表达

对Oncomine 数据库中的HOXA3 表达进一步深入提取与白血病有关的研究信息，寻找与AML 相关的研究，通过设定筛选条件：①Gene：HOXA3；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Leukemia；④Data Type：mRNA；⑤临界值设定条件（P value ＜0.001，fold change 1.5，gene rank ＝ Top 10%），共有7 个数据集涉及HOXA3 在白血病和正常组织中的表达，包括3 813 个样本。比较4 个与AML 有关的研究结果［8］发现，与对照组相比，HOXA3 在AML 中高表达，且具有显著性差异。

2.3 HOXA3 在AML 不同FAB 分型中的表达差异

将上述筛选条件中的Analysis Type 更改为Cancer Histology Analysis，重新筛选后，有19 个数据集符合条件，以TCGA Leukemia 为例，见图2A。HOXA3 在M3 中的表达低于其他类型的AML，且在M5中表达水平最高。将kasumi-1、NB4、HL60、THP1、U937 和TF-1 六种不同FAB 分型的白血病细胞株提取mRNA，反转录后进行qPCR，结果显示HOXA3 的表达与数据库结果一致，见图2B。

2.4 与HOXA3 相互作用基因的GO 富集与KEGG功能注释

下载TCGA 中AML 相关的数据，利用R 筛选出与HOXA3 共表达的基因，以相关系数≥0.4 为条件，共筛出780 个可能与HOXA3 具有共表达关系的基因。通过DAVID 数据库对上述与HOXA3 相互作用的基因进行GO 和KEGG 分析，发现这些基因在生物过程（Biological Process，BP）中主要影响细胞凋亡、白细胞迁移、造血发生、T 细胞稳态等方面，见图3A。在分子功能（Molecular Function，MF）中主要影响蛋白质结合、半胱氨酸型内肽酶激活参与的凋亡等，见图3B。细胞组分（Cellular Component，CC）中主要在细胞膜、细胞质等位置，见图3C。KEGG 代谢通路主要集中在P53、肿瘤、代谢相关等通路，见图3D。

2.5 HOXA3 蛋白互作网络

在String-DB 数据库中，检索分析与HOXA3 相互作用的蛋白，其中CTCF、PBX1、HOXB1、MAFB、KDM6A、KMT2C 等蛋白与HOXA3 关联密切（图4）。之前的文献报道PBX1 可以通过活化AKT／GSK3β 信号通路来改变细胞周期，从而促进毛囊间充质干细胞的增殖并抑制其凋亡［9］，而MAFB 对胰岛β 细胞的功能有重要作用［10］，提示HOXA3 可能通过调节细胞周期、糖代谢等影响白血病细胞的生物学功能。

2.6 HOXA3 基因表达与AML 患者预后的关系

上述分析证实AML 中HOXA3 呈高表达，为进一步分析HOXA3 与AML 患者预后的关系，在TCGA 数据库中的LAML 数据并用R 进行处理分析，利用Survival包绘图并作统计学分析，结果显示发现高表达HOXA3 的AML 患者生存期明显低于低表达者，提示HOXA3 与AML 患者的不良预后有关。

图2 HOXA3 在AML 不同FAB 分型中的表达

图3 HOXA3 相互作用基因的GO 富集和KEGG 通路分析

图4 String-DB 数据库中与HOXA3 相互作用的蛋白

3 讨论

HOX 基因家族与正常和异常造血相关，其差异表达与特定的谱系和造血分化阶段密切相关［11］。在小鼠造血干细胞中过表达HOXA10，导致髓系和B 细胞分化紊乱、巨核祖细胞扩增，从而导致白血病发生。缺乏HOXA9 的小鼠造血功能受到破坏，包括淋巴细胞、粒细胞数量减少，而过表达HOXA9 可导致T 细胞发育缺陷和AML 的发生。而且，在AML 中HOXA9 参与MLL 融合蛋白的形成，且HOXA9 的激活是一个独立的不良预后标志基因。报道［12］HOXA3 与很多恶性肿瘤的发生发展相关，HOXA3 通过调节EGFR／Ras／Raf／MEK／ERK 信号通路来影响结肠癌的发生发展，miR-338-3p 可以下调HOXA3 的表达从而抑制T 淋巴母细胞性淋巴瘤的发生。

本研究基于Ocomine 数据库分析了HOXA3 基因在不同恶性肿瘤中的表达情况，并且比较分析了4 个不同AML 数据集中HOXA3 的表达情况，发现HOXA3 在AML 中的表达高于正常对照组，且在M5中表达最高，在M3 中的表达低于其他FAB 分型的AML，同时也利用白血病细胞的qPCR 实验证实了这个结论。利用DAVID 数据库分析了与HOXA3 具有共表达关系基因的GO 富集和KEGG 通路分析，发现HOXA3 与细胞的凋亡、白细胞迁移、造血发生、肿瘤、代谢等相关，提示HOXA3 可能在白血病的发生发展中可能发挥着重要作用。同时，进行了生存分析，发现高表达HOXA3 的AML 比低表达组预后差。

虽然之前有很多关于HOX 基因家族和白血病的研究，但是关于HOXA3 和AML 的研究目前还没有相关报道，后续仍需要相关的体内、体外实验以及过表达和敲除实验来进一步验证。

4 结论

本研究首次分析了HOXA3 在AML 中的表达及其与不同病理类型和预后之间的关系，并且报道了与其相互作用的蛋白和信号通路，为AML 的诊断和治疗提供潜在的新靶点。