基于RhoA/ROCK通路研究天麻素对高血压病左心室肥厚大鼠心室重构的影响

2021-02-24侯玮琼杨勋超毛文超吴欣芳

安徽中医药大学学报 2021年1期

侯玮琼，姜北，赵岩，杨勋超，毛文超，吴欣芳

(中国中医科学院广安门医院南区内一科，北京 102618)

高血压是心血管疾病的主要危险因素之一，左心室肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)是高血压病主要的并发症之一。一方面，由于血压升高，人体左心室代偿性增厚；另一方面，高血压也成为肥厚性心肌病、心力衰竭等心血管疾病的危险因素之一。有文献记载，高血压病合并LVH在心肌梗死的致病因素中占有重要地位。因此，LVH成为心血管疾病研究的重点。Ras同族体基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,RhoA)/Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)通路作为与心肌细胞病理密切相关的信号转导途径，活化后可以促进多种物质的合成，从而直接或间接导致心肌细胞重塑的效果。因此，抑制RhoA/ROCK通路也许是治疗LVH的重要手段。天麻素作为中草药天麻的提取物，具有镇静、催眠、扩张血管、降低外周阻力、改善微循环、增加心肌血流量、保护心肌细胞和血管内皮细胞、抑制缺血再灌注引起的细胞凋亡等作用。研究表明，天麻素可降低高血压病大鼠血清超氧化物歧化酶和丙二醛水平，通过抗脂质过氧化损伤达到保护血管的作用并降低血压。本实验通过腹主动脉缩窄法复制LVH动物模型，观察天麻素对大鼠心室重构的影响并探究其作用机制。

1 材料

1.1 动物健康雄性SD大鼠100只，清洁级，8周龄，体质量为(240±20)g，购自珠海百试通生物科技有限公司[动物生产许可证号：SCXK(粤)2020—0051]。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为25 ℃，湿度为60%，实验室适应性饲养1周后用于实验研究。

1.2 药物和试剂依苏牌马来酸依那普利片(批号 20150902)：扬子江药业集团江苏制药股份有限公司；精和牌乙酰天麻素片(批号 20013048)：云南省昆明制药集团股份有限公司；大鼠血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)ELISA试剂盒(批号20071015)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA试剂盒(批号 20100328)：上海江莱生物；qRT-PCR扩增引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；TRIzol试剂(货号 15596026)：Invitrogen公司；逆转录试剂盒(货号 R123-01)、qRT-PCR试剂盒(货号 Q121-02)：南京诺唯赞公司；Western blot所用抗体：Abcam公司；一抗为兔抗RhoA单克隆抗体(ab40673)、兔抗ROCK2单克隆抗体(ab125025)，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(ab205718)。

2 方法

2.1 动物分组及模型复制将大鼠随机分为假手术组，模型组，天麻素低、中、高剂量组，依那普利组，每组15只。除假手术组外，均采用腹主动脉缩窄法复制高血压病LVH模型。腹腔注射戊巴比妥钠全身麻醉，固定，备皮，沿腹白线逐层开腹至剑突下1 cm处，以脑银夹夹住腹主动脉分叉处，使之部分狭窄，用庆大霉素冲洗伤口，逐层关腹。假手术组按同样方法分离腹主动脉，但不夹腹主动脉。术后2周，使用无创血压测量仪测量大鼠收缩压。大鼠收缩压较模型复制前提高20 mmHg以上，且高于135 mmHg，提示LVH模型复制成功。实验过程中如有大鼠死亡或模型复制失败，则及时补充大鼠。依那普利组给药剂量为每日1.5 mg/kg，天麻素低、中、高剂量分别为每日16、24、32 mg/kg。每日灌胃给药1次，共8周。假手术组和模型组用等容量生理盐水灌胃。期间每周称体质量1次，根据体质量调整给药量。

2.2 收缩压测定模型复制前，模型复制后2、4、8周，分别测量各组大鼠在安静、清醒状态时尾动脉收缩压，连续测量3次，取平均值。

2.3 ELISA法测定大鼠血清AngⅡ、IL-6水平用药8周后，各组大鼠主动脉采血，2 000 r/min离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定血清AngⅡ、IL-6水平。

2.4 左心室质量及左心室肥厚指数(left ventricular hypertrophy index, LVHI)测定将禁食12 h的大鼠麻醉后迅速打开胸腔，取出心脏，用预冷的生理盐水冲洗血液，滤纸吸干水份，取左心室游离壁和室间隔，准确称质量，作为左心室质量，左心室质量与动物体质量的比值作为LVHI。

2.5 心肌的组织形态学观察沿左心室长轴中点处留取一部分心肌组织，置于4%多聚甲醛中固定，常规方法制作石蜡切片，分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和Masson染色，观察大鼠心肌的组织形态学变化及心肌纤维化程度。将另一部分心肌置于液氮中保存。

2.6 qRT-PCR检测各组心肌组织RhoA、ROCK mRNA水平取液氮中保存的心肌，采用TRIzol等试剂提取总RNA，定量逆转录合成cDNA，然后用SYBR Green Ⅰ荧光染料技术进行qRT-PCR扩增。所用引物见表1。预变性95 ℃，5 min；循环反应：95 ℃下反应10 s，60 ℃下反应30 s，主循环40个；溶解曲线：95 ℃下反应15 s，60 ℃下反应60 s，95 ℃下反应15 s。采用2-ΔΔC法，通过C值计算目的基因相对表达水平。以β-actin作为内参。

表1 qRT-PCR引物序列

2.7 Western blot法检测各组心肌组织RhoA、ROCK蛋白表达水平取液氮保存的心肌组织，剪碎，置于玻璃匀浆器中；加入含有PMSF的裂解液，冰上反复匀浆。30 min后，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，收集上清液。配制10%分离胶、4%浓缩胶；取50 μg蛋白上样，沸水浴处理5 min使蛋白变性，冷却后上样；转膜封闭后4 ℃过夜；用TBS清洗后，加入羊抗兔IgG二抗(稀释倍数1∶1 000)，室温下孵育2 h；TBS清洗、ECL显色后置于凝胶成像仪中观察各组蛋白表达水平。

3 结果

3.1 天麻素对高血压病LVH大鼠收缩压的影响模型复制后2、4、8周，与假手术组比较，模型组大鼠收缩压均显著升高(

<0.05)。用药4周后，与模型组比较，依那普利组和天麻素高剂量组收缩压明显下降(

<0.05)。用药8周后，与模型组比较，天麻素低、中、高剂量组和依那普利组大鼠收缩压均显著降低(

<0.05)。见表2。3.2 天麻素对高血压病LVH大鼠血清AngⅡ、IL-6水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清AngⅡ、IL-6水平显著升高(

<0.05)。与模型组比较，天麻素低、中、高剂量组以及依那普利组大鼠血清AngⅡ、IL-6水平均显著降低(

<0.05)，且依那普利组大鼠血清AngⅡ、IL-6水平最低(

<0.05)。见表3。

表2 天麻素对高血压病LVH大鼠收缩压的影响

表3 天麻素对高血压病LVH大鼠血清AngⅡ、IL-6水平的影响

3.3 天麻素对大鼠左心室重构的影响与假手术组比较，模型组大鼠LVHI显著增加(

<0.05)。与模型组比较，天麻素低、中、高剂量组，依那普利组大鼠LVHI均显著降低(

<0.05)，且依那普利组大鼠LVHI显著低于天麻素高剂量组(

<0.05)。见表4。

表4 天麻素对大鼠左心室质量及LVHI的影响

3.4 6组大鼠心肌组织形态变化心肌组织经HE染色后，假手术组大鼠的心肌细胞形态及大小正常，胞浆染色清晰，排列整齐紧凑，纤维组织未见增生。模型组大鼠心肌细胞胞浆染色不清，排列紊乱，间隙消失，纤维组织大量增生，心肌组织出现增生等重构现象。依那普利组大鼠心肌组织与假手术组类似。天麻素高、中、低剂量组与假手术组比较，心肌细胞排列稍紊乱，肌纤维均有不同程度的扭曲断裂，胞浆染色尚均匀，可见少量细胞核固缩；与模型组比较，心肌细胞排列较为整齐，肌纤维断裂扭曲不明显。天麻素高、中、低剂量组和依那普利组大鼠心肌细胞形态无明显差异。Masson染色后，假手术组以红色的心肌细胞为主，心肌组织分布均匀，结构清晰，且心肌细胞间质仅见少量绿色胶原纤维。模型组大鼠心肌组织分布不均匀，结构不清晰，细胞排列紊乱，细胞间质及血管周围均可见大量绿色胶原纤维沉积，纤维化程度严重。各治疗组大鼠心肌间质纤维化程度介于假手术组和模型组之间，较模型组均有不同程度的减轻，尤以依那普利组和天麻素高剂量组减轻最为明显。见图1。

3.5 6组大鼠心肌组织RhoA、ROCK mRNA和蛋白相对表达水平比较与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织RhoA、ROCK mRNA和蛋白相对表达水平显著升高(

<0.05)。与模型组比较，依那普利组和天麻素低、中、高剂量组大鼠心肌组织RhoA、ROCK mRNA和蛋白相对表达水平均显著降低(

<0.05)，依那普利组大鼠心肌组织RhoA、ROCK mRNA和蛋白相对表达水平最低，天麻素的作用呈剂量依赖性。见表5和图2。

图1 6组大鼠心肌组织形态变化(10×20倍)

4 讨论

LVH是高血压病常见的器官损害之一，是机体对血液动力学负荷长期增加的一种适应性反应，表现为心室壁增厚、心肌质量增加等心室重塑、炎症反应以及心肌纤维化等，其形成过程涉及多种因素。LVH是高血压病维持、恶化及心力衰竭发生的结构基础，长期如此，会增加冠心病、脑卒中等严重疾病风险。本研究采用腹主动脉缩窄法复制LVH大鼠模型，结果发现模型大鼠血压升高，LVHI增加，心肌纤维结构紊乱，纤维化程度高，在间质可见水肿和炎症细胞浸润，并伴有大面积细胞坏死。

天麻素作为天麻的主要有效成分，具有降低血清炎症因子水平，抑制炎症发生，减弱氧化应激损伤的疗效。天麻可显著降低高血压病LVH患者血压，提高左心室舒张及收缩功能，对主要心血管事件的发生起到积极的预防作用，但其作用机制尚未完全阐明。AngⅡ不仅可以作用于血管平滑肌细胞，造成血管张力增加，而且能通过与其受体结合，提高胞内Ca浓度，促进血压升高，诱发心肌炎症肥大和纤维化。而IL-6是诱发炎症反应的典型因子。本实验中，相比于模型组，天麻素各剂量组血压、LVHI、心肌纤维化程度以及AngⅡ、IL-6水平均明显下降。本实验所用西药为依那普利，是一种血管紧张素转换酶抑制剂，能够通过降低AngⅡ水平，从而舒张血管，达到降血压的效果。临床上也有用天麻素联合依那普利治疗高血压病LVH的报道，效果良好。结果提示天麻素对治疗高血压病LVH大鼠心室重构具有一定效果，但具体机制仍需进一步探讨。

近年来，RhoA/ROCK通路在高血压病所导致的LVH模型中发病作用引起人们的广泛重视。Rho是一类Ras相关单体GTP酶，具有多种亚型，其中RhoA在介导细胞聚集和基因转录翻译中发挥关键性作用。ROCK是Rho下游的表达效应子，参与许多心脑血管疾病(如高血压病、动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血再灌注损伤)的发病。研究表明，高表达ROCK的大鼠模型中，血管平滑肌的紧张程度增加，从而导致血管收缩，血压升高。本实验中，模型组RhoA、ROCK mRNA及蛋白表达水平显著高于假手术组，而天麻素组及依那普利组RhoA、ROCK mRNA及蛋白表达水平较模型组均显著降低，且天麻素组RhoA、ROCK mRNA及蛋白相对表达水平下降呈一定剂量依赖性，提示天麻素可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路发挥对大鼠心肌的保护作用。