黄连对脑缺血小鼠海马组织中MDA含量的影响

张晓敏，李向阳,牛宪立,苏良辰,农瑞敏

黄连为毛茛科植物，大苦大寒，属传统中药，除了众所周知的清热解毒功效以外，越来越多的其他方面的功效逐渐被挖掘[1]。已有研究发现，黄连提取物中小檗碱有扩张血管、降低血压、调脂及抗血小板聚集等多种作用；黄连素还具有一定的抗氧化作用，对各种原因引起的脑损害具有一定保护作用[2]。缺血性脑疾病目前是致死、致残率极高的常见疾病，严重影响人体健康和人类生活质量。目前，人类在治疗脑缺血及其后遗症方面尚无特效药物。本研究通过小鼠颈部单侧总动脉结扎手术，造出小鼠缺血性脑损伤的模型，通过灌胃给药的方式研究黄连对小鼠缺血性脑损伤海马组织的作用[3]。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康的SPF成年小鼠36只，体质量约20 g，雌雄各半(遵义医学院珠海校区实验动物中心提供)。药品与试剂：黄连浸出液(熬制，稀释后含生药量2 mg/ml)、10%水合氯醛(秤取10 g的水合氯醛，溶于100 ml蒸馏水)、75%乙醇、生理盐水、MDA试剂盒、蛋白含量试剂盒(试剂盒均购于南京建成生物工程研究所)。实验仪器：离心机(飞鸽牌TDL-80-2B)、水浴箱(北京长源实验设备厂)、酶标仪(bio-tekElx800)及721分光光度计(上海现科分光仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组：将36只小鼠随机分为给药组、模型组及正常组，每组12只。分别用染色法给每组小鼠编号为1～12号，每组小鼠又分别分为6个小组，分4、6、10、12、24、48 h六个时间段取材。各小组称重记录每只小鼠的体质量，以确定小鼠的麻醉和灌胃给药剂量。所有小鼠正常饲养3 d。

1.2.2 脑缺血小鼠模型的制备：给药组和模型组小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉(0.35 ml/100 g)[4]后仰卧固定于固定板上，用75%乙醇消毒颈部手术部位后，剪开颈中正前皮肤及组织，找到小鼠右颈内动脉，用小型玻璃分针挑起小鼠动脉血管，游离出附在动脉血管上的迷走神经[5]，用手术线将小鼠右颈内动脉结扎，阻断该动脉对脑部供血。将动脉放回颈内，然后整合伤口，手术针缝合伤口，75%乙醇消毒伤口，将手术后的小鼠放在温暖的环境下等待苏醒。所有小鼠正常饲养1 d再给药。

1.2.3 给药与取材：给药组小鼠给予黄连浸出液按0.1 mg/g的剂量灌胃[6]，模型组和正常组以同样的方法按剂量灌以生理盐水。然后开始计时，4 h后，取每组小鼠的1号和2号，颈椎脱臼法处死立刻断头取脑，剥离出小鼠大脑中的海马组织；6 h后，取每组小鼠的3号和4号，颈椎脱臼法处死立刻断头取脑，剥离出小鼠大脑中的海马组织；以此类推，8 h后取每组的5号和6号，12 h后取每组的7号和8号，24 h后取每组的9号和10号，48 h后，取每组的11号和12号。剥去其他脑组织，在培养皿中用PBS清洗取下的海马组织，后转移至匀浆器，按重量体积比(g/ml)的比例加入冷PPS，制成10%的组织匀浆，转移到离心管中，2 500 rmp/s离心15 min，收集上清液。准确吸取上清液0.1 ml，加入PPS 0.9 ml稀释为10%的上清液，冰箱-20 ℃保存。

1.3 观察指标 (1)小鼠行为学变化；(2)海马MDA含量测定：取10%上清液，按照蛋白含量试剂盒说明书，96孔板上样后，通过酶标仪测定各组样本的蛋白含量，换算原始匀浆组织中蛋白含量，为下一步测定组织中MDA含量做准备。取10%组织匀浆上清液，严格按MDA试剂盒说明书步骤操作，紫外分光光度计测定每个样品的吸光度，按说明书的公式计算每个样品的MDA含量，记录数据，取每个时间段样品MDA含量的平均值通过Excel 2003绘制图表，生成曲线图。

2 结 果

2.1 小鼠的脑供血情况 右颈总动脉结扎手术苏醒后给药组和模型组小鼠均出现行动迟缓，反应迟钝，食欲不振，前行路线明显不成直线，摇摆不定的现象。说明右颈动脉结扎手术可能造成小鼠大脑供血不足，影响小鼠的行为。正常组小鼠较给药组和模型组灵活，反映灵敏，食量正常。

2.2 小鼠海马组织中MDA含量 MDA含量测定结果见表1，曲线图见图1。

表1 MDA含量测定结果 (nmol/ml)

图1 小鼠海马组织中MDA含量曲线图

2.3 不同处理组间MDA含量比较 取每个时间段两个样本的平均值，进行单因素方差分析：首先进行主体间效应的检验：MDA含量结果显示，3组不同处理组间比较差异有统计学意义(F=11.918，P=0.042)，时间区组间比较差异无统计学意义(F=3.072，P=0.197)。进一步做处理组间的两两多重比较。见表2。

表2 不同处理组间MDA含量比较

3 讨 论

脑血管疾病主要发生于中老年人群体，随着社会人口老龄化程度加重，脑血管疾病已成为备受社会关注的焦点之一。而多数脑血管疾病，如动脉硬化，脑血栓均与脑缺血引起的疾病有关。在我国，脑缺血是脑血管主要病种之一，其致残和病死率仅次于恶性肿瘤，在临床上如何预防和治疗脑缺血引起的组织损伤和保护神经细胞已成为研究的重点问题[7]。人类脑血管病一般发生在动脉的某一分支，最常见的是大脑中动脉。以手术造成的小鼠局灶性脑缺血模型与人类脑血管疾病相似，能很好地模拟临床中大脑中动脉梗死这一现象[8]。大多数关于这方面的研究均选择用大鼠或小鼠动脉结扎手术建立脑缺血模型，因为小鼠的脑部血管结构近似于人类，来源充足，容易饲养，存活率高，而且价格合理[9]。

有研究表明，脂质过氧化作用是脑缺血导致的主要炎性反应之一[10]，MDA是机体中多种不饱和脂肪酸在氧自由基的作用下发生脂质过氧化作用而形成的一种脂质过氧化物之一。不饱和脂肪酸的过氧化作用能引起细胞损伤，因而组织中的MDA的含量高低往往可间接反映组织细胞的损伤程度[11-12]。本研究结果显示：正常组的小鼠海马组织中的MDA含量总体较给药组和模型组低，且波动不大，与小鼠海马组织不受损伤的理论基本符合。模型组MDA含量较正常组高，且随时间上升，可能是因为小鼠海马组织供血不足而造成损伤，随时间的推移损伤程度增加，MDA含量随之增加。给药组MDA含量总体较正常组高，随时间推移而上下波动，给药4～8 h，MDA含量不断上升，因为可能是黄连浸出液药效还未发挥作用或吸收的量不足，小鼠的海马组织损伤程度随缺血时间增加；8～24 h，MDA含量不断下降到一个较低的水平，因为可能是黄连浸出液的功效发挥作用，使小鼠海马组织得到一定的保护，MDA含量随之降低；24～48 h，MDA含量又呈升高的趋势，原因可能是黄连浸出液在小鼠体内已消耗完，导致小鼠海马组织又进入缺血性损伤状态，MDA含量又开始升高。由此可见，黄连浸出液在一定程度上降低脑缺血小鼠海马组织中的MDA含量，对脑缺血小鼠的海马组织有一定的保护作用。