冠状动脉性心脏病患者肠道菌群数量与血脂及同型半胱氨酸水平的相关性

石 翠，袁 宇

（新乡医学院第一附属医院心血管内科，河南 卫辉 453100）

心血管疾病尤其是冠状动脉性心脏病（coronary heart disease，CHD）影响全世界约2 360万人，是许多发展中国家的重要公共卫生问题［1］。世界卫生组织预测，心血管疾病在2030年仍将是导致死亡的主要原因之一［1］。导致CHD发展的主要危险因素包括高血压、高脂血症、胰岛素抵抗和肥胖等。近10 a来，越来越多的证据表明，肠道微生物群的功能和变化与心血管疾病相关［2］。本研究通过探讨CHD患者肠道菌群与血脂及同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）水平的关系，为临床进一步预防及治疗CHD提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2019年5月至2019年8月新乡医学院第一附属医院心血管内科收治的CHD患者50例为研究对象（CHD组）。病例纳入标准：（1）符合国际心脏病学会制定的CHD诊断标准［3］；（2）冠状动脉造影显示至少有1支冠状动脉狭窄程度≥50%。排除标准：（1）妊娠期及哺乳期妇女；（2）过敏体质者；（3）1个月以内应用抗生素、抗微生物制剂、益生菌等药物影响肠道菌群者；（4）患有肝脏疾病、肾脏疾病（血清肌酐＞20.0 mg·L-1）、消化道疾病、胶原病或恶性肿瘤等；（5）有酗酒、高血压、糖尿病、免疫性疾病等影响胃肠道菌群者。另选择同期健康体检者30例为对照组。CHD组：男29例，女21例；年龄40～73（63.51±9.64）岁；体质量指数（body mass index，BMI）16.9～24.6（20.33±1.12）kg·m-2；空腹血糖4.7～6.0（4.98±1.33）mmol·L-1。对照组：男17例，女13例；年龄36～75（59.63±10.32）岁；BMI 16.6～23.7（18.45±1.23）kg·m-2；空腹血糖4.0～5.9（4.25±1.12）mmol·L-1。2组受试者的性别、年龄、BMI、空腹血糖比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会审核批准，受试者及其家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器血脂、HCY测定试剂购自北京九强生物技术股份有限公司，细菌RNA提取试剂盒购自常州百代生物科技有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成；全自动生物化学分析仪购自日本日立公司，实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自瑞士Roche公司，台式高速冷冻型微量离心机购自德国Eppendorf公司，超微量分光光度计购自美国Themo公司。

1.3 2组受试者血脂和HCY水平检测抽取2组受试者入院次日清晨肘静脉血5 mL，使用全自动生物化学分析仪检测血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）及HCY水平。

1.4 粪便的采集及肠道菌群RNA提取收集2组受试者治疗前的新鲜粪便样本约5.0 g，置于无菌冷冻试管，封口后立即置于-4℃冰箱保存，使用细菌RNA提取试剂盒提取细菌总RNA，并置于-80℃冰箱保存。

1.5 实时荧光定量PCR法检测肠道细菌数量采用反转录试剂盒将细菌总RNA反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测2组受试者大肠杆菌、乳酸杆菌及双歧杆菌的数量。PCR反应体系：2×SYBR® Super Mix Plus 10μL，cDNA模板1μL，上、下游引物各1μL，灭菌双蒸水7μL。PCR反应程序：95℃5 min；95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，45个循环。试验设置标准品和阴性对照。肠道细菌数量以每克粪便中细菌拷贝数的自然对数表示。

1.6 统计学处理应用SPSS 21.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料用中位数（四分位数）描述，组间比较采用非参数秩和检验；采用Spearman进行相关性分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组受试者血脂及HCY水平比较结果见表1。与对照组比较，CHD组受试者血清TC、TG、LDL、HCY水平均显著升高，HDL水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 2组受试者血脂及HCY水平比较Tab.1 Comparison of the levels of blood lipid and HCY of subjects between the two groups

2.2 2组受试者粪便中双歧杆菌、乳酸菌及大肠杆菌数量比较结果见表2。与对照组比较，CHD组受试者粪便中的双歧杆菌和乳酸菌数量显著降低，大肠杆菌数量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 2组受试者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌数量比较Tab.2 Comparison of the amount of Bifidobacterium，Lactobacillus and Escherichia coli in the stool of subjects between the two groups lnN·g-1

2.3 2组受试者肠道菌群数量与血脂及HCY水平的关系结果见表3。2组受试者血清TC水平与双歧杆菌数量呈负相关（P＜0.05），与乳酸杆菌及大肠杆菌数量无相关性（P＞0.05）；血清TG水平与双歧杆菌数量呈负相关（P＜0.05），与大肠杆菌数量呈正相关（P＜0.05），与乳酸杆菌数量无相关性（P＞0.05）；血清HDL水平与双歧杆菌及乳酸杆菌数量呈正相关（P＜0.05），与大肠杆菌数量呈负相关（P＜0.05）。对照组受试者血清LDL水平与双歧杆菌数量呈正相关（P＜0.05），CHD组受试者血清LDL水平与双歧杆菌数量无相关性（P＞0.05）；对照组受试者血清LDL水平与乳酸杆菌数量无相关性（P＞0.05），CHD组受试者血清LDL水平与乳酸杆菌数量呈正相关（P＜0.05）；对照组受试者血清LDL水平与大肠杆菌数量呈负相关（P＜0.05），CHD组受试者血清LDL水平与大肠杆菌数量无相关性（P＞0.05）。2组受试者血清HCY水平与双歧杆菌数量呈负相关（P＜0.05），与大肠杆菌数量呈正相关（P＜0.05），与乳酸杆菌数量无相关性（P＞0.05）。

表3 2组受试者血清HCY、TG、TC、LDL及HDL水平与双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌数量的相关性Tab.3 Correlation between the serum HCY，TG，TC，LDL and HDL levels and the amount of Bifidobacteria，Lactobacilli and Escherichia coli of subjects in the two groups

3 讨论

CHD是导致心脑血管疾病患者死亡的主要原因，其危险因素包括血脂异常、高血压、肥胖和糖尿病等。流行病学和临床研究结果表明，CHD与TC水平呈正相关，与HDL水平呈负相关［4］。MCCULLY在1969年报道了1例高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）婴儿存在广泛的血管损害，提示HHcy与血管性疾病关系密切［5］。近几年，越来越多的研究表明，HCY水平升高与心血管疾病密切相关，是CHD的独立危险因素［6］。本研究发现，CHD组受试者血清TC、TG、LDL、HCY水平较对照组显著升高，HDL水平显著降低，提示控制血脂及HCY水平仍是治疗CHD的主要措施。

益生菌即活的“有益”细菌，可调节肠道菌群紊乱。越来越多的研究证明，益生菌的补充可降低胆固醇水平并抑制动脉粥样硬化病变［7］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活Toll样受体4和巨噬细胞释放促炎症细胞因子，导致内皮细胞功能障碍、斑块形成和破裂，以及LDL的氧化和血栓形成。有研究证明，口服双歧杆菌可以降低粪便和血浆中LPS的浓度，减轻小鼠动脉粥样硬化的形成［8］。肠道菌群可以代谢含甲胺的营养物质（如胆碱、卵磷脂和左旋肉碱），并生成三甲胺（trimethylamine，TMA），TMA在黄素单加氧酶的作用下生成三甲胺N-氧化物（trimethylamine oxide，TMAO）。TMAO可以通过抑制胆固醇逆向转运，并通过诱导血管细胞中促进动脉粥样硬化的炎症相关蛋白来促进动脉粥样硬化［9-10］。TMAO水平升高与血栓形成有关，TMAO可以促进血小板活化［11］，因此，TMAO水平与心血管事件的发生及心血管疾病的流行密切相关［9，12］。补充益生菌或改变饮食结构可以改变TMA前体的产生，抑制TMAO的生成，进而抑制动脉粥样硬化。肠道菌群被认为是维生素的来源，肠道菌群可产生叶酸，且产生叶酸的量是连续恒定的，不受肠道环境（外源性维生素水平、pH值、碳源等）的影响［13］。有研究发现，双歧杆菌能产生叶酸、维生素B6、维生素B12等多种维生素，并且在肠道中合成的叶酸可以直接被宿主吸收和利用，从而降低血液中HCY的水平［14］。有研究证明，双歧杆菌产生的叶酸可降低血液透析患者的HCY水平［15］。本研究发现，CHD组受试者双歧杆菌和乳酸杆菌数量显著低于对照组，大肠杆菌数量显著高于对照组，提示CHD患者肠道菌群可能出现紊乱，益生菌数量减少，机会病原菌数量增加。本研究Spearman相关性分析结果显示，受试者血清中TC、TG、HDL、LDL、HCY水平与肠道微生物数量密切相关，肠道微生物在CHD患者血脂及HCY调节中发挥重要作用。

综上所述，肠道菌群乳酸菌、双歧杆菌及大肠杆菌可能参与CHD的发展，并与血清TC、TG、HDL、LDL及HCY水平相关，但其治疗CHD的潜在优势和局限性有待进一步研究，改善肠道微生物数量有望成为治疗CHD的新途径。