微RNA-708-5p对结核性脑膜炎小鼠脑损伤的影响

吴 芳，郭 俊，李 蓓，齐红艳

（1.西安市儿童医院神经内科，陕西 西安 710000；2.唐都医院神经内科，陕西 西安 710000）

结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是中枢神经系统结核病中最常见的一种，是由结核分枝杆菌侵入蛛网膜下腔，随脑脊液扩散，引起脑膜、脑实质及脊髓非特异性炎症反应的疾病，病死率高达20%～25%［1-2］。由于患者机体环境、免疫抑制剂的广泛应用等因素［3-4］，临床上对TBM的治疗效果不佳，因此，需要研究TBM的发病机制，为临床治疗提供思路。微RNA（microRNA，miR）在转录后通过调节特定信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻译来调控靶基因的表达［5］，并参与调节多种生物过程［6-7］。研究表明，miR-708-5p在人和小鼠中具有高度同源性，且在TBM等多种疾病中表达升高［8-9］，但miR-708-5p在TBM中的作用和分子调控机制尚不清楚。因此，本研究通过小鼠体内和体外实验来探究miR-708-5p对TBM的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、菌株及细胞6周龄健康雄性BALB/c小鼠，体质量21～33（27.40±3.62）g，由陕西省医学实验动物中心提供。小鼠在12 h昼夜节律下分笼饲养，室温18～25℃，空气湿度45%～65%，保证小鼠自由饮食与运动。结核分枝杆菌H37Rv（ATCC27294）和小鼠脑膜细胞GIBH001购自美国Type Culture Collection公司。

1.2 主要试剂与仪器RPMI 1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）购自美国Hyclone公司，青霉素、链霉素、胰蛋白酶购自美国Sigma公司，伊文思蓝溶液、Tris缓冲生理盐水（Tris-buffered saline and Tween-20，TBST）购自上海阿拉丁生物科技有限公司，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司，TRIzol试剂盒购自上海联迈生物工程公司，放射免疫沉淀测定（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液购自上海碧云天生物有限公司，增强型化学发光（enhanced chemical luminescence，ECL）试剂购自上海源叶生物科技有限公司；miR-708-5p mimic、miR-708-5p inhibitor及其相应的对照物NC-mimic、NC-inhibitor购自广州日博生物有限公司，补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1（complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1，C1qtnf1）过表达质粒及其对照物Vector购自美国Addgene公司，脂质体Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司，荧光素酶报告基因质粒购自美国Promega公司，鼠抗兔多克隆磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自艾博抗（上海）贸易有限公司；微量注射器购自北京友成嘉业生物科技阴限公司，电子分析天平购自贝士德仪器科技（北京）有限公司，Spectronix 3000紫外分光光度计购自美国Bio-Tek公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRTPCR）仪购自日本Bio-Rad公司，凝胶成像分析仪购自广州瑞丰实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及TBM 小鼠模型制备应用随机数字表法将48只小鼠分为假手术组、TBM 组、TBM+miR-708-5p inhibitor组及TBM+NC-inhibitor组，每组12只。小鼠经腹腔注射0.1 mg·L-1的水合氯醛（3 mL·kg-1）进行麻醉。TBM 组、TBM+miR-708-5p inhibitor组及TBM+NC-inhibitor组小鼠经尾静脉注射0.2 mL的结核分枝杆菌H37Rv菌悬液（2.5×109CFU·L-1）制备TBM模型，假手术组小鼠给予等体积的PBS。造模成功后，miR-708-5p inhibitor组、TBM+NC-inhibitor组小鼠分别经尾静脉注射0.2 mL miR-708-5p inhibitor（2 mg·kg-1）、NC-inhibitor（2 mg·kg-1），每2 d注射1次，连续1周。

1.3.2 小鼠脑组织取材4组小鼠经尾静脉注射伊文思蓝溶液（4 mL·kg-1），循环1 h后，主动脉灌注50 mL冰冷的PBS，脊椎脱臼法处死各组小鼠，剪开头颅部位皮肤漏出颅骨，用镊子从下向上逐步去除小鼠颅骨，当全脑露出时，小心用眼科镊去除脑膜和血管，获得小鼠脑组织。获取小鼠脑组织后，一部分脑组织立即采用干湿法检测脑组织含水量，另一部分脑组织于-80℃冷冻保存待用。

1.3.3 干湿法检测各组小鼠脑组织含水量取4组小鼠脑组织并分为同侧和对侧皮层、同侧和对侧基底神经节及小脑5个部分，并立即称湿质量（wet weight，WW），待各部位脑组织干燥24 h后测量干质量（dry weight，DW）。各组小鼠脑组织含水量=（WW-DW）/WW×100%。

1.3.4 伊文思蓝实验检测各组小鼠血脑屏障通透性取4组冻存的小鼠脑组织在PBS中均浆，4℃、12 000 r·min-1离 心30 min，收集上清液。每500 mL上清液中加入等体积的体积分数50%三氯乙酸，4℃孵育过夜后，4℃、12 000 r·min-1离心30 min，采用紫外分光光度计在波长610 nm处测定伊文思蓝的吸光度值。根据不同浓度伊文思蓝标准样品的吸光度值绘制标准曲线，并按照标准曲线计算各组小鼠脑组织中伊文思蓝渗出量（以伊文思蓝渗出量表示小鼠血脑屏障通透性）。

1.3.5 ELISA法检测各组小鼠脑组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平取4组冻存的小鼠脑组织进行匀浆，将标准蛋白样品和待检测的各组脑组织样品分别加入被一抗包被好的96孔板中，严格按照TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测450 nm波长处的吸光度值。根据已知标准蛋白浓度的吸光度值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算各组待测样品中TNF-α和IL-1β的水平。实验重复3次，取均值。

1.3.6 qRT-PCR 法检测各组小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相对表达量应用TRIzol试剂提取4组冻存的小鼠脑组织的总RNA，提取方法按照试剂盒说明书进行。使用反转录试剂盒将2μg总RNA反转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），并进行qRT-PCR，反应条件为：95℃10 min；95℃30 s，60℃60 s，72℃30 s，共40个循环。miR-708-5p上游引物序列为5′-GGCGCGCAAGGAGCTTACAATC-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；C1qtnf1上游引物序列为5′-TTGGTGGCTTCTGCTGGTTATGG-3′，下游引物序列为5′-TGTCCTGGTTCTCCTGCGTCTC-3′；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列为5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物序列为5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′。采用2-ΔΔCt法计算各组小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.3.7 细胞培养、转染将GIBH001细胞培养于37℃、含体积分数5%CO2的培养箱中，使用含100 U· mL-1青霉素、100 mg· L-1链霉素和体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。收集对数生长期GIBH001细胞，以每孔3×105个细胞接种于24孔板，待细胞密度达70%左右时进行转染。根据转染载体的不同，将细胞分为对照组、miR-708-5p过表达组、C1qtnf1过表达组及miR-708-5p+C1qtnf1过表达组，每组设4个复孔。分别转染NC-mimic和Vector、miR-708-5p mimic和 Vector、NC-mimic和pcDNA-C1qtnf1、miR-708-5p mimic和pcDNA-C1qtnf1。另根据转染载体的不同，将细胞分为空白组、NC-inhibitor组及miR-708-5p inhibitor组，每组设4个复孔。空白组细胞不做处理，NC-inhibitor组、miR-708-5p inhibitor组细胞分别转染NC-inhibitor、miR-708-5p inhibitor。转染操作按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行。细胞转染后继续恒温培养6 h，更换含体积分数10%胎牛血清的培养液并继续培养，转染24 h后收集各组细胞进行后续实验。

1.3.8 Western blot法检测各组小鼠脑组织和GIBH001细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相对表达量取4组冻存的小鼠脑组织以及转染后培养24 h的各组GIBAH001细胞，使用RIPA裂解液提取脑组织和细胞总蛋白，测定蛋白浓度。取15μL蛋白上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，使用转膜仪将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，在体积分数5%脱脂牛奶中封闭1 h后，用TBST漂洗3次，每次5 min，随后分别加入PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、Akt（1∶500）、p-Akt（1∶500）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶400），室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL试剂显色，以β-actin为内参，采用全自动凝胶成像分析仪进行拍照和定量分析，以待测目的蛋白与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量，并计算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt。

1.3.9 qRT-PCR 法检测 GIBH001细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量各组细胞转染24 h后，根据TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。取3μg总RNA，按反转录试剂盒说明获取cDNA，并进行qRT-PCR。qRT-PCR 反应条件、C1qtnf1和内参GAPDH的引物序列及相对表达量的计算方法同“1.3.6”。实验重复3次，取均值。

1.4 统计学处理应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠脑组织含水量比较结果见表1。TBM组小鼠脑组织同侧基底神经节含水量显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠脑组织同侧基底神经节含水量显著低于TBM+NC-inhibitor组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TBM 组和TBM+NCinhibitor组小鼠脑组织同侧基底神经节含水量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。4组小鼠对侧皮质、对侧基底神经节、同侧皮质及小脑含水量比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 4组小鼠脑组织含水量比较Tab.1 Comparison of water content in brain tissue of mice among the four groups ±s）

表1 4组小鼠脑组织含水量比较Tab.1 Comparison of water content in brain tissue of mice among the four groups ±s）

注：与假手术组比较a P＜0.05；与TBM+NC-inhibitor组比较b P＜0.05。

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2.2 4组小鼠血脑屏障通透性比较假手术组、TBM组及TBM+NC-inhibitor组及TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠伊文思蓝渗出量分别为（1.00±0.27）、（4.95±0.33）、（5.12±0.29）、（1.12±0.35）μg·g-1。TBM组小鼠血脑屏障通透性显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠血脑屏障通透性显著低于TBM+NC-inhibitor组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TBM组与TBM+NC-inhibitor组小鼠血脑屏障通透性比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 4组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平比较结果见表2。TBM组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平显著低于TBM+NC-inhibitor组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TBM 组与TBM+NCinhibitor组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 4组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平比较Tab.2 Comparison of the levels of TNF-αand IL-1βin brain tissues of mice among the four groups （±s）

表2 4组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平比较Tab.2 Comparison of the levels of TNF-αand IL-1βin brain tissues of mice among the four groups （±s）

注：与假手术组比较a P＜0.05；与TBM+NC-inhibitor组比较b P＜0.05。

组别 n TNF-α/（ng·L-1） IL-1β/（ng·L-1）假手术组12 42.55±10.36 30.17±6.78 TBM组 12 203.56±14.67a 186.47±12.06a TBM+NC-inhibitor组 12 210.78±15.64 178.65±11.62 TBM+miR-708-5p inhibitor组 12 53.57±12.54b 43.12±11.63 b

2.4 4组小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相对表达量比较结果见表3。与假手术组比较，TBM组小鼠脑组织中miR-708-5p相对表达量显著升高，C1qtnf1 mRNA相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与TBM+NC-inhibitor组比较，TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠脑组织中miR-708-5p相对表达量降低，C1qtnf1 mRNA相对表达量升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TBM组与TBM+NC-inhibitor组小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 4组小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相对表达量比较Tab.3 Comparison of the relative expression of miR-708-5p and C1qtnf1 mRNA in brain tissues of mice among the four groups （±s）

表3 4组小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相对表达量比较Tab.3 Comparison of the relative expression of miR-708-5p and C1qtnf1 mRNA in brain tissues of mice among the four groups （±s）

注：与假手术组比较a P＜0.05；与TBM+NC-inhibitor组比较b P＜0.05。

组别 n miR-708-5p C1qtnf1 mRNA假手术组12 1.00±0.09 0.99±0.09 TBM组 12 2.48±0.21a 0.29±0.10a TBM+NC-inhibitor组 12 2.40±0.20 0.28±0.09 TBM+miR-708-5p inhibitor组 12 1.05±0.11b 0.98±0.10 b

2.5 4组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较结果见图1和表4。TBM组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著低于TBM+NC-inhibitor组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TBM组和TBM+NC-inhibitor组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 4组小鼠脑组织中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达（Western blot）Fig.1 Expression of PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt protein in brain tissues of mice in the four groups（Western blot）

表4 4组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较Tab.4 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in brain tissues of mice among the four groups （±s）

表4 4组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较Tab.4 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in brain tissues of mice among the four groups （±s）

注：与假手术组比较a P＜0.05；与TBM+NC-inhibitor组比较b P＜0.05。

组别 n p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt假手术组12 1.02±0.16 1.02±0.15 TBM组 12 2.64±0.14a 2.46±0.13a TBM+NC-inhibitor组 12 2.52±0.20 2.57±0.22 TBM+miR-708-5p inhibitor组 12 1.05±0.17b 1.02±0.14 b

2.6 4组GIBH001细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较结果见图2和表5。miR-708-5p过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C1qtnf1过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著低于C1qtnf1过表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1过表达组与对照组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 4组GIBH001细胞中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达（Western blot）Fig.2 Expression of PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt protein in GIBH001 cells in the four groups（Western blot）

表5 4组GIBH001细胞中PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt比较Tab.5 Comparison of PI3K/p-PI3K and Akt/p-Akt in GIBH001 cells among the four groups （±s）

表5 4组GIBH001细胞中PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt比较Tab.5 Comparison of PI3K/p-PI3K and Akt/p-Akt in GIBH001 cells among the four groups （±s）

注：与对照组比较a P＜0.05；与C1qtnf1过表达组比较b P＜0.05。

组别 n p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt对照组12 1.01±0.05 1.00±0.12 miR-708-5p过表达组 12 2.44±0.13a 2.49±0.14a C1qtnf1过表达组 12 0.39±0.12a 0.32±0.11a miR-708-5p+C1qtnf1过表达组 12 0.98±0.09b 1.03±0.16 b

2.7 各组GIBH001细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量比较对照组、miR-708-5p过表达组、C1qtnf1过表达组、miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量分别为1.03±0.14、0.31±0.12、2.48±0.10、1.04±0.09。miR-708-5p过表达组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C1qtnf1过表达组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量显著低于C1qtnf1过表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1过表达组与对照组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

空白组、NC-inhibitor组、miR-708-5p inhibitor组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量分别为1.01±0.07、1.03±0.06、0.33±0.07。NC-inhibitor组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-708-5p inhibitor组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量显著低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-708-5p inhibitor组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量显著低于NC-inhibitor组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

miRNAs通过转录后阶段来调控靶基因的表达，且miRNAs的异常表达与许多疾病过程相关。miR-708-5p参与多种生理病理过程，如在肥胖及其相关疾病中，miR-708-5p是肾素血管紧张素系统的潜在靶点［10］；在心律失常心肌病小鼠模型中的致病作用［11］；在衰老和长寿的关键通路中也占据重要位置［12］。本研究发现，TBM组小鼠脑组织中miR-708-5p的相对表达量较假手术组显著升高，提示miR-708-5p参与TBM的发生。

炎症因子是由免疫原或其他刺激激活后合成、分泌的一类低分子质量可溶性的生物活性物质，在TBM发生后的免疫反应中发挥着重要作用，可作为早期TBM的诊断依据［13-14］。本研究结果显示，TBM组小鼠脑组织中TNF-α和IL-1β水平显著高于假手术组，这与文献报道相符合［13-14］；而持续的炎症反应又会导致血脑屏障的破坏和脑水肿的扩张，因此，TBM组小鼠脑组织中伊文思蓝渗出量和同侧基底神经节含水量均显著高于假手术组。而TBM+miR-708-5p inhibitor组小鼠脑组织中TNF-α 和IL-1β水平、伊文思蓝渗出量、小鼠脑组织同侧基底神经节含水量较TBM+NC-inhibitor组显著降低，说明抑制miR-708-5p的表达可改善TBM小鼠的血脑屏障结构、减轻脑水肿、抑制脑组织中TNF-α和IL-1β的表达水平。

miRNAs通过调控下游靶基因来发挥其生物学功能。C1qtnf1是C1q/TNF相关蛋白家族的一员［15］。作为一种新型的脂肪因子，C1qtnf1在调节机体分泌、免疫以及心血管生理、病理方面发挥着重要的作用［16］。本研究发现，TBM 组小鼠脑组织中C1qtnf1 mRNA的相对表达量显著低于假手术组；miR-708-5p inhibitor组小鼠脑膜细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量显著高于NC-inhibitor组；提示C1qtnf1在TBM 中同样发挥着重要的作用，且miR-708-5p通过抑制C1qtnf1的表达参与小鼠脑损伤。

PI3K/Akt通路参与多种疾病的发展过程，脑组织内的炎症反应可能是通过调节PI3K/Akt通路来实现的。本研究通过检测p-PI3K和p-Akt蛋白表达量来观察PI3K/Akt通路是否参与TBM小鼠脑损伤，结果表明，TBM 组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt水平显著高于假手术组，提示PI3K/Akt通路可能参与TBM 的发生、发展；miR-708-5p过表达组小鼠脑膜细胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt显著高于对照组，提示miR-708-5p通过激活PI3K/Akt通路参与TBM小鼠脑损伤的过程。

综上所述，抑制miR-708-5p的表达可有效缓解TBM小鼠的脑损伤，其具体作用机制为miR-708-5p通过调控C1qtnf1/PI3K/Akt轴来参与TBM诱导的小鼠脑损伤过程。本研究为寻找TBM潜在治疗靶点奠定一定的基础，但是本研究仅从动物和细胞水平验证了miR-708-5p的表达对TBM的影响，后续研究可考虑收集TBM患者的临床资料进行组织水平的研究，探讨miR-708-5p的表达与TBM患者的临床病理特征及预后的关系，以期为TBM的预后及治疗提供新的生物学标记和靶点。