异丙酚对脑出血大鼠继发性脑损伤的影响

郝建红,张 洁,吴赞情,董补怀,罗振国

(西安交通大学附属红会医院麻醉科,西安 710000;*通讯作者,E-mail:luckyhao722@sina.com)

脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是第二大中风类型,约占所有中风的15%,世界范围内ICH发病率约为25/100 000,亚洲为50/100 000[1]。脑出血死亡率高达40%,并且会遗留不同程度的后遗症,给个人、家庭和社会带来沉重负担[2]。因此,研究脑出血病理生理机制,探索新的治疗靶点具有重要意义。脑出血患者有时需要手术治疗,必然涉及麻醉用药。异丙酚是一种静脉麻醉药,该药物具有起效快、诱导平稳、苏醒快等优点,广泛应用于外科手术病人的麻醉和重症监护室病人的镇静。目前多项研究证明异丙酚具有脑保护作用[3-5]。本研究旨在观察异丙酚对脑出血大鼠血脑屏障功能的影响,进一步探讨异丙酚脑保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠45只,年龄约8周,体质量约200 g,购自我院动物实验中心。将45只SD大鼠于恒温下饲养,给予自由饮水和摄食,并于术前12 h禁食。所有动物的处置方法均符合动物伦理学的要求。

1.1.2 主要药物 异丙酚(批号为0912211 XLH09,四川国瑞药业有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 45只SD大鼠随机分为3组:假手术组、ICH组和异丙酚组,每组15只。ICH组和异丙酚组采用右苍白球注射胶原酶Ⅶ的方法制备ICH模型:以65 mg/kg剂量的戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,大鼠麻醉后固定在脑立体定向仪上,以前囟为原点,前0.1 mm,外侧3.5 mm,腹侧6.0 mm作为穿刺点,进针深度5.5 mm,用10 μl微量注射泵以1 μl/min注入2.5 μl胶原酶Ⅶ,留针10 min后缓慢退针,用骨蜡封闭其骨孔,消毒缝合切口,将大鼠置于笼中观察,待其麻醉复苏。假手术组进行同样的手术,但没有胶原酶输注。脑出血诱导4 h后,异丙酚组的大鼠经股静脉泵注异丙酚1.0 mg/(kg·min),持续1 h。

1.2.2 行为学测试 在ICH诱导后第7天行Corner Test检查大鼠神经行为功能。将大鼠放置在一个由两块30 cm×20 cm×1 cm平板构成的30°的夹角里,让它们自由地向左或向右转离这个角落。正常小鼠向左或向右转身的几率基本相等,而一侧脑损伤的小鼠则以向脑损伤同侧(右侧)转身为主[6]。在15次试验中,每只大鼠右转的次数被记录下来。

1.2.3 脑核磁检查 术后7 d每组取3只大鼠,以65 mg/kg剂量的戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,行头部MRI检查。采用Philips 3.0T archive intera超导MR系统及膝关节相控阵线圈采集图像。扫描序列:T2WI、FLAIR、DWI(b=0,1 000 s/mm2)。

1.2.4 组织学观察 MRI检查后将大鼠在麻醉状态下开胸,暴露心脏,用10%多聚甲醛固定液灌注。先灌注50 ml,之后用微量静脉输液泵滴注100 ml固定液,以出血灶为中心取1.5 cm脑组织进行外固定。经过常规的70%-100%的乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡浸透包埋后,做连续切片,切片厚度约为5 μm,贴在多聚赖氨酸防脱片剂处理过的载玻片上。切片常规脱蜡至水,苏木素-伊红染色。在光镜下观察脑神经元病理形态学改变。

1.2.5 脑组织含水量测定 术后7 d每组取6只大鼠,将大鼠实施安乐死。大鼠安乐死后取右侧大脑半球称重(湿重),然后在100 ℃下干燥24 h,得到干重。Eliot公式计算脑组织含水量(brain water content,BWC),BWC=[(湿质量-干质量)/湿质量]×100%。

1.2.6 血脑屏障完整性评估 术后7 d每组取6只大鼠,应用伊文思蓝外渗试验评估血脑屏障完整性。麻醉后经大鼠尾静脉注射2%伊文思蓝溶液(2 ml/kg),注射2 h后用生理盐水灌流,迅速取脑,生理盐水冲洗,滤纸吸取剩余的水分,称取100 mg右侧脑组织,放置于3 ml甲酰胺溶液中,充分匀浆后在37 ℃与甲酰胺孵育24 h,将匀浆液12 000 r/min离心10 min,取200 μl上清液加入96孔板中,于632 nm处测量吸光度值,制作伊文思蓝标准曲线,利用标准曲线计算伊文思蓝含量。脑组织伊文思蓝含量(μg/g)=伊文思蓝浓度(mg/L)×甲酰胺体积(ml)/脑组织湿质量(g),从而计算出各组大鼠脑组织中伊文思蓝含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 行为学测试结果

与假手术组相比,ICH组和异丙酚组大鼠右转次数增多,异丙酚组大鼠右转次数较ICH组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与假手术组比较,*P<0.05;与ICH组比较,#P<0.05

2.2 大鼠脑部MRI检测结果

ICH组、异丙酚组大鼠脑部MRI可见类圆形低密度影的血肿,及血肿周围环绕的高密度水肿带,ICH组较异丙酚组脑水肿范围大。假手术组未见明显血肿及水肿带(见图2)。

A.假手术组 B.ICH组 C.异丙酚组

2.3 组织学观察

光镜下观察可见假手术组神经元形态规则,白质致密。ICH组和异丙酚组神经元破坏,白质松散不规则,炎性细胞浸润。异丙酚组损伤改变相对ICH组较轻(见图3)。

A.假手术组 B.ICH组 C.异丙酚组

2.4 脑组织含水量

与假手术组相比,ICH组和异丙酚组大鼠脑组织含水量增多,异丙酚组大鼠脑组织含水量较ICH组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。

与假手术组比较,*P<0.05;与ICH组比较,#P<0.05

2.5 脑组织伊文思蓝水平

与假手术组相比,ICH组和异丙酚组右侧大脑半球伊文思蓝水平明显上升,异丙酚组右侧大脑半球伊文思蓝水平较ICH组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,见图5)。

与假手术组比较,*P<0.05;与ICH组比较,#P<0.05

3 讨论

脑出血的损伤可分为两个连续不可分割的过程,包括原发性脑损伤和继发性脑损伤[7]。原发性脑损伤,主要发生在ICH后0-4 h,是指ICH后血凝块对大脑造成的物理损伤,脑出血后几天内血肿增大,颅内压升高,压迫脑部相关区域,导致脑缺血。继发性脑损伤发生在脑出血后4 h,主要是指原发性脑损伤触发的血肿和凝血的级联病理反应[8,9]。

脑水肿是典型的脑出血继发性脑损伤,其严重程度与脑出血患者的临床预后密切相关[7]。脑出血超急性期出现血肿周围水肿。水肿量在脑出血后24 h内显著增加,在3 d内迅速进展。脑水肿的迅速发展可导致颅内压升高甚至脑疝。

血脑屏障(blood brain barrier,BBB)损伤引起的血管源性脑水肿是脑出血后脑水肿的重要机制之一[10]。脑损伤后血脑屏障的破坏导致脑水肿,进而导致脑细胞凋亡坏死,引起神经功能的破坏,因此在脑损伤后减轻血脑屏障破坏至关重要[11,12]。

血脑屏障是介于血液和脑组织之间的对物质通过有选择性阻碍作用的动态界面,它有选择地过滤物质进入脑组织,保持脑组织内环境的基本稳定,对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义[13]。血脑屏障由连续毛细血管内皮及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞以及星形胶质细胞脚板围成的神经胶质膜构成[14]。其中,内皮是血脑屏障的主要结构,脑血管内皮细胞的数量和通透性在很大程度上决定了血脑屏障的功能[15]。脑损伤后内皮细胞之间的紧密连接被破坏,血脑屏障通透性增加,导致脑组织含水量增加[16]。伊文思蓝在正常情况下与血清蛋白结合不能通过血脑屏障,在脑损伤后血脑屏障通透性增高,导致伊文思蓝进入脑组织,因此伊文思蓝染色被认为是评估血脑屏障通透性和血管源性水肿的一种简单可靠的方法[17]。本实验中,脑出血大鼠脑组织含水量和伊文思蓝含量增加,脑组织水肿明显,进一步证实大鼠脑出血后脑血管内皮细胞之间的紧密连接被破坏,血脑屏障通透性增高,出现血肿周围水肿,引起继发性脑损伤。

目前,麻醉药对脑损伤的保护作用已有了大量研究,许多研究证明异丙酚具有潜在的神经保护作用,因此成为一种极具潜力的脑保护药物而备受国内外学者的高度关注。但是,异丙酚神经保护作用的机制目前尚未完全阐明。文献报道异丙酚可以抗凋亡、抗氧化、清除体内自由基,降低脂质过氧化物,同时可以抑制谷氨酸受体,降低谷氨酸的释放,降低细胞外谷氨酸的浓度[18-21]。鉴于血脑屏障损伤引起的血管源性脑水肿在脑出血继发性脑损伤的重要作用,我们把注意力转移到异丙酚对脑出血大鼠血脑屏障及继发性脑损伤的影响。本实验中,异丙酚注射显著改善了ICH大鼠的行为和组织学特征,包括减少右转次数,减少伊文思蓝外渗,降低脑含水量,减轻脑组织水肿,证实异丙酚可显著减轻脑出血大鼠血脑屏障的破坏,减轻脑出血大鼠继发性脑损伤。

综上所述,大鼠脑出血后脑血管内皮细胞之间的紧密连接被破坏,血脑屏障通透性增高,出现血肿周围水肿,引起继发性脑损伤。异丙酚可降低脑出血大鼠血脑屏障的通透性,减轻脑出血大鼠继发性脑损伤。我们的研究结果将为今后临床脑出血后神经元的保护提供新的线索和方法。