规模化猪场猪大肠杆菌的耐药性及相关耐药基因检测

邓珊珊，张 海，蔺俐仲，徐春志，袁 林

（1.贵阳市清镇市农业农村局，贵州 贵阳 551400；2.贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550081；3.贵阳市草地站，贵州 贵阳 550081；4.贵阳市息烽县农业农村局，贵州 贵阳 550300）

细菌性腹泻是引起仔猪腹泻的主要病因之一，在非洲猪瘟疫情防控和政府对养猪业的大力支持下，近两年来养殖规模不断的扩大，由于部分养殖场缺乏专业技术人员和有效的防护措施，仔猪细菌性腹泻的发病率逐渐增加，给养猪业的发展造成了严重的经济损失。仔猪感染细菌性腹泻可致仔猪产生严重的水样腹泻、呕吐、脱水，严重的可导致仔猪死亡[1]。引起仔猪腹泻的主要病原菌有大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、链球菌和志贺氏菌等[2]。大肠杆菌是人和动物肠道中最常见、数量较多的细菌，当人和动物的机体免疫力下降时，细菌就会大量繁殖从而产生毒素，而引起机体发病。由于致病性大肠杆菌的血清型较多，目前没有较为有效的疫苗预防[3]。在临产床上常常使用抗生素治疗仔猪的细菌性腹泻，由于抗生素不合理使用和滥用，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，甚至出现了多重交叉耐药株，使得在临床对大肠杆菌病的治疗变得越来越困难。

为了解贵州省某规模化猪场腹泻大肠杆菌的耐药情况，本研究对临床上分离到的20株猪源大肠杆菌进行药物药敏试验和相关耐药基因的PCR检测，同时对细菌的耐药性和相应耐药基因关系进行分析，为临床合理用药及大肠杆菌多重耐药机制的进一步研究提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年5月至2020年7月在贵州嘉农种猪养殖有限公司进行。

1.2 菌株

20株分离自贵州省某规模化养猪场送检的腹泻仔猪样本的猪源大肠杆菌，由贵阳市动物疫病预防控制中心分离、纯化、鉴定、保存。

1.3 主要试剂和培养基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000、细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，营养琼脂培养基和营养肉汤培养基购自杭州微生物试剂有限公司。

1.4 药敏纸片与药敏试验

试验所用的抗菌药物包括β-内酰胺类的头孢拉定、头孢克洛、氨苄西林、青霉素、阿莫西林，氨基糖苷类的庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、链霉素、新霉素，氟喹诺酮类的恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、吡哌酸、诺氟沙星，共15种兽医临床常用药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。药敏纸片琼脂扩散法参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的标准进行，药敏结果判断标准按NCCLS 2010年标准作出结果判断。

1.5 引物设计与合成

参照GenBank上已发布的9种畜禽病原菌的相关耐药基因序列，分别为β-内酰胺类耐药基因CTX、SHV、TEM，氟喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrS、qnrB，氨基糖苷类耐药基因aacC4、addA1、aacC2，运用引物在线设计软件设计特异性引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6 细菌基因组DNA的提取

按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取试验菌株基因组DNA。

1.7 耐药基因的PCR扩增

以提取的大肠杆菌细菌基因组DNA为模板，按照25 μL PCR反应体系分别加入各组分试剂2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1.5 μL，下游引物（10 μmol/L）1.5 μL，灭菌双蒸水7.5 μL进行PCR扩增。扩增结束后，取PCR产物8.0 μL进行电泳。

表1 耐药基因PCR扩增引物序列

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌分离株药敏试验结果

对分离20株致仔猪腹泻猪大肠杆菌进行药敏试验，结果见表2。由表2结果显示，分离的20株猪大肠杆菌对环丙沙星高度耐药，耐药率为100.00%（20/20）；对其余抗菌药物的耐药率分别为：阿莫西林、吡哌酸耐药率为95.00%（19/20），青霉素耐药率为90.00%（18/20），氨苄西林耐药率为85.00%（17/20），诺氟沙星耐药率为80.00%（16/20），恩诺沙星耐药率为75.00%（15/20），头孢拉定耐药率为60.00%（12/20），卡那霉素、氧氟沙星耐药率为45.00%（9/20），对新霉素、丁胺卡那、头孢克洛、庆大霉素、链霉素的耐药率分别为40.00%（8/20）、30.00%（6/20）、30.00%（6/20）、25.00%（5/20）、20.00%（4/20）。

分离出来的20株致仔猪腹泻大肠杆菌中没有对所有的抗菌药物完全敏感的菌株。20株大肠杆菌对两类以上的抗菌药物产生了耐药性，其中对β-内酰胺类（阿莫西林、青霉素）和氟喹诺酮类（环丙沙星和吡哌酸）耐药最为普遍。20株大肠杆菌对10余种抗菌药物有多重耐药性。

表2 20株大肠杆菌分离株对15种抗菌药物敏感性试验

2.2 耐药基因的PCR扩增结果

对20株大肠杆菌进行TEM、CTX、SHV、addA1、aacC2、aacC4、qnrA、qnrB和qnrS的PCR扩增，均能扩增出特异性目的片段，将目的片段回收后送测序公司进行测序。测序结果显示，阳性菌株所携带的抗生素耐药基因与GenBank中参考耐药基因的序列同源性在98%以上，说明筛选出的9种耐药基因是本试验要检测的基因。耐药基因检测结果汇总见表3。

由表3可得，该规模化猪场20株猪大肠杆菌分别扩增出β-内酰胺类耐药基因CTX-M、TEM和SHV的菌株比例分别为50.00%（10/20）、40.00%（8/20）和35.00%（7/20）；扩增出氟喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB和qnrS的菌株比例分别为35.00%（7/20）、15.00%（3/20）和20.00%（4/20）；扩增出氨基糖苷类耐药基因addA1、aacC2和aacC4的菌株比例分别为75.00%（15/20）、80.00%（16/20）和65.00%（13/20）。

表3 20株大肠杆菌耐药基因检测情况

3 讨论

本研究调查了分离自贵州省某规模化猪场致仔猪腹泻的20株大肠杆菌对3类15种抗菌药物的药物敏感性和耐药情况，以及采用PCR检测法对9种耐药基因携带情况，并进行耐药基因与耐药表型相关性的分析。

该猪场致腹泻大肠杆菌抗生素药物敏感性高于50%的有8种抗生素，其中4种属于β-内酰胺类、4种属于氟喹诺酮类，药物敏感性超过80%的药物有环丙沙星100.00%（20/20），阿莫西林95.00%（19/20）、吡哌酸95.00%（19/20）、青霉素90.00%（18/20）、氨苄西林85.00%（17/20），检测结果与徐引弟等[4]研究人员的研究结果相似，提示临床上应谨慎用药。诺氟沙星、恩诺沙星、头孢拉定、氧氟沙星、卡那霉素，在临床上可选择性用药。新霉素、丁胺卡那、头孢克洛、庆大霉素、链霉素，在临床上可以继续使用。20株大肠杆菌对两类以上的抗菌药物产生了耐药性，其中对β-内酰胺类（阿莫西林、青霉素）和氟喹诺酮类（环丙沙星和吡哌酸）耐药最为普遍。20株大肠杆菌对10余种抗菌药物有多重耐药性。该猪场20株大肠杆菌耐药基因氨基糖苷类耐药基因检测率最高，addA1、aacC2和aacC4的菌株比例分别为75.00%（15/20）、80.00%（16/20）和65.00%（13/20）。β-内酰胺类耐药基因次之，CTX-M、TEM和SHV的菌株比例分别为50.00%（10/20）、40.00%（8/20）和35.00%（7/20）。耐药基因检测结果与药物敏感试验结果存在一定的相关性。耐药基因的检测有助于了解该规模化养猪场大肠杆菌流行株耐药基因存在的种类、数量及流行规律，能够更好地指导临床用药，以降低大肠杆菌的耐药性。

大肠杆菌是条件致病菌，其发病率与猪场的饲养管理、卫生情况、气候、温度等有很大的关系，因此加强饲养管理、注意养殖环境卫生状况和做好保暖措施等都可以大幅减少大肠杆菌引起的仔猪腹泻。临床上选择敏感药物，交替使用，从而减少耐药性的产生，提高治疗效果。