猪腹泻相关的冠状病毒检测方法研究进展

向 萌，陈弟诗，任玉鹏，王一丹

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

猪腹泻病是危害养猪业主要的传染病之一，其中以病毒性腹泻的发生率最高、危害最严重[1]。冠状病毒是引起仔猪腹泻的重要病原，主要包括猪流行性腹泻病毒 （Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒 （Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）、猪德尔塔冠状病毒 （Porcine delta corona virus, PDCoV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV）[2]。4种病原感染猪均以呕吐、腹泻、脱水和肠道出血为主要特征，且常常呈现隐性感染或多病原混合感染，给相关疫病的诊断带来了困难。PEDV和TGEV是目前分布最广的猪腹泻病毒性病原，对哺乳仔猪致死率可达100%[3]，近5年来在我国四川、福建、吉林、陕西、甘肃、黑龙江、江苏、山东、辽宁、广西和河北等多个省份均有流行[4-6]。PDCoV自2012年首次发现于中国香港后迅速蔓延至世界各地，在我国猪群中检出率日益增长，成为危害我国养猪业的重要病原[7]。如2017—2018年，在河南地区猪腹泻样本中，PDCoV阳性率达35.06%，与PEDV混合感染率达24.03%[8]。此外，SADS-CoV也是近年出现的引起猪群消化道症状的一种新型猪冠状病毒，在2016年于我国广东首次发现。据统计，仅2017年由这种病毒引起的国内猪只死亡数达25 000头，造成了较大的经济损失[9-10]。

PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV均能引起仔猪腹泻，具有相似的临床症状和病理特征，还呈现出旧病新发、新病频发的流行特点，给疾病的快速鉴别检测带来了巨大困难。此外，当前国内基层兽医对仔猪病毒性腹泻诊断时，往往优先考虑为PEDV和TGEV感染，而忽视对PDCoV和SADS-CoV等新发病原的检测。因此，本文对前述4种引起猪腹泻的冠状病毒检测方法相关研究资料进行总结，以期为猪病毒性腹泻的快速诊断、精准防控提供理论指导和技术参考。

1 病原分离培养法

病毒分离培养法是病毒性疾病传统又重要的检测手段，其优点在于检测结果准确性和可靠性高，同时也为后续深入研究病原特性提供了重要材料。目前常用猪肾细胞（PK-15，IBRS2）和猪睾丸细胞（ST）培养TGEV。如陈焕春等[11]将阳性TGEV肠系膜淋巴结处理后在IBRS2细胞系中盲传9代后出现明显的细胞病变。自1988年Hofmann等[12]用非洲绿猴肾细胞（Vero）成功分离PEDV，并且检测可稳定传代后，这种方法便一直沿用至今。但当前国内外对PDCoV和SADS-CoV的分离培养体系尚未完全确定。有证据表明，PDCoV阳性样品处理后，能在猪的近端肾小管细胞系（LLC-PK）中稳定有效地增殖，并在连续传代15次后，出现明显的细胞病变[13]。虽然病毒分离培养法具有重要意义，但由于过程相对耗时，且不同毒株对宿主细胞的易感性和培养条件存在差异，因此该方法不适用于临床上对病原的快速检测。

2 血清学检测法

2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是最常用的血清学诊断技术之一，对疾病的初步诊断和抗体监测具有重要意义，主要包括间接ELISA、双抗夹心ELISA和抗体捕获ELISA等，而冠状病毒高度保守的囊膜蛋白（Membrane, M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,N）为冠状病毒重要的结构蛋白，均能诱导机体产生细胞免疫，常被作为包被抗原。同时M、N蛋白氨基酸序列高度保守，不同冠状病毒N蛋白氨基酸序列同源性在15%～30%之间，以此建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性。如杨朋霞等[14]以PEDV纯化重组的N蛋白作为包被抗原建立了PEDV的间接ELISA方法，用该方法与商品化试剂盒检测结果符合率达99.6%，此方法能在一定程度上反映猪群的抗体水平，但并不能真实反映猪体的免疫保护力，只有中和抗体才是真实反映猪只机体的抗病力指标。因纤突蛋白（Spike protein, S） 在各冠状病毒种内或种间具有较高的遗传变异性，也是介导病毒粒子进入细胞和诱导机体产生中和抗体的关键。因此选用该蛋白保守区作包被抗原，可有效鉴别不同毒株引起的感染。例如：Thachol等[15]建立了以PDCoV S1蛋白保守区域作为抗原的间接ELISA方法并应用于PDCoV抗体检测，该方法不易与其他冠状病毒发生交叉反应，具有良好的特异性；此外，陈静等[16]以纯化的重组PEDV中国变异株S蛋白为包被抗原，建立了检测PEDV流行株抗体的间接ELISA方法，该方法具有较高的特异性，与RT-PCR检测结果符合率达100%，可能成为监测PEDV流行情况的有效方法。

2.2 免疫层析技术

近年来免疫层析技术由于其特异、简便、快速的特点在兽医临床上被广泛应用，具有巨大的发展潜力和应用前景。免疫层析技术是基于抗原抗体特异性反应的一种新型膜检测技术，通过肉眼可见的标记物使检测结果直接可观。目前常见的免疫层析技术主要包括胶体金免疫层析技术、荧光免疫层析技术以及磁珠免疫层析技术等，其中PEDV和TGEV胶体金免疫层析技术在猪冠状病毒的诊断中最为常见。如贾宇旻等[17]根据PEDV免疫BALB/c 小鼠后分泌的MAb中的 4H为检测抗体、5A9 为捕获抗体初步建立了检测 PEDV 的胶体金免疫层析技术，该方法最低检测限为 7.8×103TCID50/mL，与RT-PCR法符合率达93%，为兽医基层对PEDV的快速诊断提供了新的技术手段。但目前关于猪腹泻相关的几种新型冠状病毒的免疫层析技术研究相对匮乏，仍需科研工作者不断突破。

2.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法，通过荧光素标记抗原或抗体的方法对组织、细胞内的抗原或抗体进行检测，从而实现对抗原定性、定位和定量的分析，该方法对病原的血清学检测以及病原在组织细胞内的动态分布研究具有重要意义，但也存在方法耗时长、对实验室及操作人员技术要求高等缺陷，而不适用于临床样本检测。马思奇等[18]早在1982年就用免疫荧光法检查扁桃体应用于活体诊断TGE，既适用于早期感染，也适用于慢性或隐性带毒猪的诊断，对猪腹泻病的早期诊断具有重要的意义。近年来免疫荧光技术在猪腹泻相关冠状病毒检测中也在不断发展，但目前主要见于PEDV和TGEV免疫荧光技术研究的报道。如朱蕴暖等[19]利用TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗，荧光素FITC标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，建立了TGEV的间接免疫荧光检测方法，该方法具有良好的特异性，为TGEV病原学检测提供技术支撑，为TGEV感染细胞后的定位和动态分布提供了有效的检测手段，也为猪腹泻相关冠状病毒感染机制的研究打下前期基础。

3 分子生物学检测方法

3.1 反转录聚合酶链式反应

聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction,PCR）是目前检测猪腹泻相关冠状病毒最常用的手段，其最大的特点是能将微量的DNA大幅扩增，可用于检测疑似感染猪的粪便、直肠拭子或肠道样品中的基因组。通过保守基因M、N建立的猪冠状病毒RT-PCR检测方法，特异性好、准确性高，可为疾病诊断提供更准确、更科学的信息，但此方法在临床上无法区分野毒株和疫苗株以及不同型毒株，因此针对S基因以及ORF3基因建立的RTPCR检测方法对病原的分型以及深入的分子机制研究具有重要意义。如阚蕊慈等[20]根据PEDV野毒株和疫苗株ORF3基因的差异设计特异性引物，建立了可区分PEDV野毒株和疫苗株的多重RT-PCR方法，为PEDV的快速精准检测提供了有效的工具。此外，由于猪腹泻相关的冠状病毒在感染猪群后具有相似的临床症状，众多学者致力于对病原快速鉴别诊断的研究，多重RT-PCR技术应运而生，得到广大学者的支持。如韦学雷等[21]根据PDCoV N基因、PEDV M基因和TGEV N基因序列，建立了能同时检测3种猪冠状病毒的多重RT-PCR方法，有良好的临床应用价值。黄海鑫等[22]根据PDCoV和SeACoV N基因建立的双重RT-PCR方法，最低检测量为4.73×101copies/μL，为两种猪新型冠状病毒快速检测提供了新的技术手段。

3.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，通过检测荧光信号强度直接对产物进行定性分析和定量分析。目前关于PEDV、TGEV和PDCoV的荧光定量PCR检测技术已趋向成熟，国内外众多学者建立了多种针对单一或多个病原的荧光定量PCR检测方法，如王以欣等[23]建立的基于双启动寡核苷酸引物检测PEDV的荧光定量PCR方法对质粒标准品最低检测限为1.64×101copies/μL，组内、组间重复性结果的变异数均小于1%，可为PEDV准确、快速的临床检测提供技术支持。此外，施开创等[24]针对PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和猪轮状病毒VP6基因建立的4重TapMan荧光定量RT-PCR检测方法对相关病毒的快速诊断更是具有重要意义，但目前关于SADS-CoV的荧光定量PCR检测方法的研究相对较少，亟待补充。

3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新的DNA扩增方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，利用4对特异性的引物在等温条件下1 h内即能扩增出 1×109copies的靶序列，该方法无需昂贵的试验设备及试剂，操作简单，结果直观，是当前病原检测方法研究热点之一。目前已有LAMP检测技术应用于猪冠状病毒的检测，但在兽医临床上并未广泛应用。如焦韵洁等[25]建立的TGEV可视化RT-LAMP检测方法在恒温水浴锅中1 h即可完成检测，比普通PCR方法高2个数量级，并以羟基萘酚蓝为指示剂，使结果直接可观。Zhang等[26]建立的PDCoV RT-LAMP 的检测方法，敏感性比普通PCR高出100倍左右，与巢式PCR符合率为100%。可见LAMP方法为猪群冠状病毒的基层诊断及病原流行病学调查提供了更为有效的手段。

4 新型检测方法在猪冠状病毒检测中的应用

随着分子生物学技术及其交叉学科的不断发展，近年来多种简便快捷的新型病原分子检测方法不断涌现，如：恒温热隔绝式PCR （Insulated isothermal PCR, iiPCR）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase Amplification, RPA）和微滴式数字PCR（Droplet digital PCR, ddPCR）。iiPCR是一种基于Rayleigh-Benard对流原理的新型扩增技术[27]。利用仪器底部单一热源加热，使毛细管内部液体自然对流形成PCR各步骤反应所需温度而实现PCR扩增，针对此方法研发的小型核酸分析仪器，反应时间仅需42 min，检测结果直接显示于屏幕，与传统荧光定量PCR方法相比，缩短了反应时间，操作更加简便，更是达到了检测仪器的小型化而适用室外快速检测。该技术于2002年首次报道以来[28]，已有多种病原的iiPCR技术相继问世，但iiPCR在猪冠状病毒的检测仅见于PEDV和PDCoV。如沈思思等[29]采用PEDV S基因设计引物和探针，建立了用于检测PEDV的iiPCR，其灵敏度高于普通荧光定量PCR方法，具有良好的应用价值。目前关于iiPCR检测技术的报道仅见于单病原的检测，因此在临床检测时需考虑多个病原，防止漏检。RPA被称为可以替代PCR的核酸扩增技术，该技术依赖于重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶3种重要组分，无需特殊控温仪器，在25～42 ℃条件下就能实现对DNA或者RNA的扩增，也可结合凝胶电泳、测流层析试纸条、荧光探针和生物芯片等多种技术检测结果，真正意义上实现了病原检测的快速便捷，但RPA技术正处于不断发展过程中，其引物及探针设计尚不成熟，还需要研究者进行摸索优化。目前RPA在猪冠状病毒检测中的应用不为常见，但肖帅等[30]建立的PDCoV的RPA方法具有高特异性及灵敏性，为猪腹泻相关冠状病毒新型RPA检测方法的建立奠定了基础。ddPCR为第3代PCR技术[31]，该技术通过将样品无限稀释至纳米级微滴，使每个微滴形成独立的反应体系，通过终点信号计算靶分子的拷贝数，该方法是在荧光定量PCR基础上发展而来，不依赖于标准曲线和Ct值，实现了病原的绝对定量[32]。该技术不仅能对单一病原进行定量的分析，亦可对两种病原同时检测。但目前尚未有同时检测3种及以上病原的ddPCR检测方法的报道。目前已有PEDV和TGEV双重微滴数字PCR商品化试剂盒投入市场，并取得了良好的临床效果。上述新型分子生物学诊断技术为疫病病原更加快速、精准、高效检测提供了可能。

5 小结与展望

猪腹泻相关冠状病毒给世界各地的养猪业均造成了巨大威胁，而快速精准的诊断是疫病防控的关键之一。目前关于猪冠状病毒检测方法的研究多集中于血清学和分子生物学检测方法。其中ELISA、免疫层析等血清学检测方法成本低、操作简单快速，可满足大批量样本检测，在基层兽医临床诊断和血清抗体监测中得到广泛应用，但也存在特异性、敏感性相对较低的缺点。而传统分子生物学检测方法如PCR、多重PCR、荧光定量PCR等技术在特异性和灵敏性上有了大幅度的提高，实现了对病原定性到定量的分析，单一病原到多重病原的鉴别检测，提升了检测效率及准确率，可快速鉴别多种肠道病原以及快速区分不同基因型，但仍需要较高的试验条件和成本而不适用于大规模的临床样本和基层兽医诊断。近年出现的ddPCR、iiPCR和RPA技术等新型分子检测技术正在克服血清学技术和传统PCR技术的弊端，为病原更加快速、便捷和高效地检测提供了可能，也是猪冠状病毒检测方法研究的新方向。