某核心种猪场猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验

王 迪，李泽伟，段倩倩，李 国，程家园，李 郁

（安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036）

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae, PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobczcillus pleuropeumonicze, APP）引致的猪的一种高度接触性的呼吸道传染病，对生猪生产的影响因APP血清型、环境和机体免疫因素不同等而异，主要临诊特征为急性出血性、纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性、坏死性胸膜肺炎[1]。PCP呈世界性分布，传播力强，尤其是近年随着我国猪场规模化、集约化的发展及跨区频繁引种，其发病率和死亡率均有上升，目前流行日渐严重，现已成为我国猪群中主要的细菌性呼吸道传染病之一，造成了养猪业巨大经济损失。APP根据荚膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性差异，可分为15种血清型；依照生长是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），又分为两个生物型，即生物Ⅰ型（NAD依赖型）和生物Ⅱ型（非NAD依赖型），其中血清1～12型和15型归为生物Ⅰ型，血清13型和14型归为生物Ⅱ型。不同国家或地区流行血清型并非一致，相同血清型之间临床致病力也不尽相同，且不同血清型之间交叉保护力较弱，尤其是目前市场上存在的商品化疫苗仅涉及血清1、3和7型，致使疫苗免疫效果常不确实或免疫失败，从而使该病的防制难度进一步增大。

2020年7月，某核心种猪场260～300日龄后备母猪出现体温升高、呼吸困难、咳嗽等症状，发病率为100%，病死率为4%。剖检后其肺呈紫红色，伴有出血，且在肺的心叶、尖叶和隔叶出现病灶，与正常组织界线分明，胸腔存在积液。通过对病原的分离鉴定，确定该猪场存在APP感染，并根据药敏试验筛选出高敏药物，试验结果不仅为猪场临床治疗及有效防控提供科学依据，同时也为区域性APP流行动态调查提供相应参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料为某种猪场4份260～300日龄病死后备母猪肺脏，相关试验于2020年7—8月在安徽农业大学动物传染病实验室开展。

1.2 主要试验材料

0.6 %酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）购自绍兴天恒生物科技有限公司；新生小牛血清购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker购自天根生化科技有限公司；17种抗生素（环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、头孢唑林、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、丁胺卡那、复方新诺明、多西环素、红霉素、阿莫西林、氨苄西林、青霉素、卡那霉素和四环素）购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 质控菌株

金黄色葡萄球菌CMCC 26112、大肠杆菌CMCC 44113均购自中国药品生物制品检定所。

1.4 细菌的分离培养及形态学观察

无菌采取4份病死猪肺脏接种于TSA-YE培养基（含5%小牛血清及1.5% NAD），采用需氧、微需氧、厌氧3种培养方式，置37 ℃条件下培养18～24 h，观察细菌的生长情况，并挑取单个可疑菌落进行革兰氏染色，镜检，观察其形态特征。

1.5 引物合成

参照文献[2-4]设计PCR鉴定APP及其血清型、毒力基因型引物（表1）。引物均由合肥通用生物科技有限公司合成。

1.6 分离菌株的PCR鉴定

利用煮沸法提取分离菌基因组DNA作为模板，用于PCR鉴定APP。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，3个循环；95 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上进行观察，并记录结果。

1.7 APP NAD依赖试验

将鉴定为APP的分离株分别接种于NAD阳性（含5%小牛血清及1.5% NAD）和NAD阴性（只含5%小牛血清，不含NAD）的TSA-YE培养基上。同时用金黄色葡萄球菌单个菌落在TSA-YE培养基（只含5%小牛血清，不含NAD）上划一横线，再将鉴定为APP的分离株垂直接种于横线两侧，置37 ℃条件下培养24 h后观察其生长情况。

表1 PCR鉴定APP及其血清型、毒力基因型引物序列

1.8 APP血清型鉴定

参照1.6提取APP模板DNA，用于PCR鉴定血清型。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反应条件：95 ℃5 min；95 ℃ 50 s，62 ℃ 50 s ，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上进行观察，并记录结果。

1.9 APP毒力基因鉴定

参照1.6提取APP模板DNA，用于PCR鉴定4种毒力基因（ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ和Omp2）。ApxⅡ、ApxⅢ、Omp2基因PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。ApxⅣ基因PCR反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min、54.8 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上进行观察，并记录结果。

1.10 APP毒力基因分析

将含目的基因片段的PCR产物纯化后测序，采用MEGA 6.02软件对获得的毒力基因序列进行序列同源性分析，并用Maximum Likeihood tree方法分别构建APP的毒力基因序列系统发育树进行遗传进化分析。

1.11 药物敏感性试验

采用Kirby-Bauer纸片法。将APP分离株培养物用0.5麦氏比浊管校正菌液浓度后，在MHA培养基（含5%小牛血清及1.5% NAD）表面均匀涂布接种100 μL，室温干燥5 min后，选择17种药敏纸片贴于琼脂表面，置37 ℃条件下培养18～24 h后观察结果。结果根据美国临床试验室标准委员会（CLSI/NCCLS）2016版执行标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养及形态学观察

自每份病死猪肺脏中均分离1株细菌，共计4株。分离菌在TSA-YE培养基（含5%小牛血清及1.5% NAD）上培养24 h后，均呈圆形、表面光滑、灰白色半透明的水株样菌落。厌氧培养与需氧培养时，细菌生长较快，微需氧培养次之；经涂片染色镜检，分离菌为革兰阴性短杆菌，两端钝圆，具有典型的多形性，呈细小短杆状，少数为长丝状，符合APP的形态学特征。

2.2 分离菌株的PCR鉴定

利用APP特异性引物对4株分离菌进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照出现342 bp扩增条带、阴性对照无条带出现，试验结果成立。4株分离菌PCR扩增产物与阳性片段大小均相符，确定为APP，分别命名为HB1、HB2、HB3和HB4（图1）。

图1 4株分离菌的PCR扩增结果

2.3 APP NAD依赖试验

HB1、HB2、HB3和HB4菌株在NAD阳性的TSA-YE培养基上均生长良好，在NAD阴性的TSAYE培养基上均不生长。在金黄色葡萄球菌周围均呈典型“卫星现象”生长，愈靠近金黄色葡萄球菌菌落生长愈大，反之愈小，甚至不见菌落生长，均符合生物Ⅰ型APP特征。

2.4 APP血清型鉴定

利用8对不同血清型的APP引物对HB1、HB2、HB3和HB4菌株进行PCR扩增。结果显示，该4株生物Ⅰ型APP均获得977 bp目的片段，与预期片段的大小相符，确定为血清8型（图2）。

图2 4株APP的血清型PCR鉴定结果

2.5 APP毒力基因鉴定

对HB1、HB2、HB3和HB4菌株的ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ和Omp2毒力基因进行PCR检测，结果显示，该4株APP均出现750 bp的Omp2目的条带（图3）和1 200 bp的ApxⅣ目的条带（图4），与预期结果一致，进一步通过测序后上传GenBank进行比对，分别确定为Omp2和ApxⅣ毒力基因。但4株菌均未检测到ApxⅡ和ApxⅢ毒力基因。

图3 Omp2毒力基因的PCR鉴定

图4 ApxⅣ毒力基因的PCR鉴定

2.6 APP毒力基因分析

序列同源性分析结果表明，HB1、HB2、HB3和HB4菌株之间的Omp2基因核苷酸序列的相似度为100%，高度同源，与11株APP参考菌株的相似度在98.6%～100%之间，其中与2株丹麦株（登录号：U86677.1和U86681.1）、3株日本株（登录号：AB007586.1、AB007585.1和AB007578.1）的相似度达100%，同源性很高（图5）。HB1、HB2、HB3和HB4菌株之间的ApxⅣ基因核苷酸序列的相似度也为100%，高度同源，与9株APP参考菌株的相似度在96.4%～99.5%之间，其中与1株德国株（登录号：CP001091.1）的相似度达99.8%，同源性也很高（图6）。构建的Omp2和ApxⅣ基因系统发育树显示，HB1、HB2、HB3和HB4菌株的Omp2基因序列处于同一分支且与2株丹麦株（登录号：U86677.1和U86681.1）、3株日本株（登录号：AB007586.1、AB007585.1和AB007578.1）聚为同一分支（图7）；ApxⅣ基因序列处于同一分支且与1株德国株（登录号：CP001091.1）位于同一分支，遗传关系均密切（图8）。

图5 Omp2毒力基因核苷酸序列的同源性比较

图6 ApxⅣ毒力基因核苷酸序列的同源性比较

图7 Omp2毒力基因核苷酸序列系统发育树分析

图8 ApxⅣ毒力基因核苷酸序列系统发育树分析

2.7 药物敏感性试验

根据CLSI/NCCLS执行标准判断，质控菌株的抑菌圈大小在规定范围内。HB1、HB2、HB3和HB4菌株对环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、头孢唑林、头孢曲松均100%敏感，对青霉素、卡那霉素、四环素100%耐药，对其他8种药物也表现出不同程度耐药（表2）。

表2 HB1—HB4菌株药物敏感性试验结果

3 讨论

APP主要定植于猪的呼吸道并且具有高度宿主特异性。调查显示，在猪4周龄时APP即可定植其上呼吸道，而发病一般在6～12周龄之后的肥育期。带菌猪和病猪是PCP的主要传染源，传播途径主要为气源感染，即通过猪只之间的直接接触或短距离的飞沫传播；还可通过被APP污染的车辆、工具、器械以及饲养人员流动等间接传播；鼠类和鸟类也能传播PCP。感染猪的鼻腔、扁桃体、支气管和肺脏等部位是APP存在的主要场所。PCP虽多发于冬春季节，但易受外界因素影响，如气温骤变、湿度过高、通风不良、饲养环境的突然改变、混群、转群、拥挤、长途运输等应激因素可促使本病的发生和流行。此外，猪群感染猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌等病原后，也可使其对APP的易感性增强[5]。

PCR技术鉴定APP，具有敏感性高、特异性强、诊断速度快的特点，是目前病原分子生物学诊断中常用的方法。本试验针对某核心种猪场260～300日龄后备母猪出现的病情，在掌握进行相关信息的基础上，包括饲养数量、饲养方式、免疫接种、发病时间、病程进展、用药情况、发病率与病死率等，以及发病时的临床表现和病理剖检变化，利用常规细菌学鉴定方法，对采集的4头发病猪病料组织进行细菌分离培养与APP分离菌的生物型确定，应用PCR技术对分离菌进行APP及其血清型鉴定、毒力基因检测以及分离菌之间亲缘关系的确定。检测结果表明，4份病料均分离出APP，且同为生物Ⅰ型、血清8型菌株，均检测到毒力基因Omp2和ApxⅣ而无ApxⅡ、ApxⅢ，菌株之间的Omp2和ApxⅣ基因核苷酸序列相似度达100%，并处于系统发育树的同一分支，4株APP分离菌高度同源，该猪场后备母猪出现的APP感染为同一菌株。APP血清型众多，分布广泛，不同国家和地区流行的优势血清型存在差异，即使是同一地区也会随时间的迁移而发生变化。在国外，欧洲以2、3、7、8和9型为主；北美地区以1、3、5和7型为主；日本、韩国则以2、4和5型为主。1995—2004年韩国以血清2、5型最为流行，但至2012—2013年血清1、5型呈现优势。在国内，优势血清型多集中于7、1和3型，其次为5、11、10和13型。山东地区以5、7和10型为主；湖北地区以13、1和11型为主；广东地区以3、10型为主[6]。1996—2000年，多个省份地区血清1、3和7型处于优势，2015—2018年，在流行的APP血清型中又增加了5、10、11和13型[7]。本试验APP分离株为血清8型，尽管与目前主要的流行血清型不同，且相关报道不多，但由于APP各血清型之间交互免疫力差，现有的商品化疫苗不能对其感染提供保护，因此该血清型的出现应引起高度重视，实时监测APP血清型的动态流行情况，对于APP疫苗的研发以及预防该菌的感染具有重要意义。

对PCP的综合防制措施主要包括加强饲养管理、药物防治、预防接种等。免疫接种是预防本病的有效方法，但要根据具体情况选择含有相对应APP血清型的疫苗。对受威胁但未发病的猪群，可以进行预防性给药。对于发病猪群，早期及时治疗是有效降低损失的方法。药敏试验结果显示，4株APP分离株对环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、头孢唑林和头孢曲松均100%敏感，可作为首选治疗药物，对青霉素、卡那霉素和四环素均100%耐药，对链霉素、庆大霉素、丁胺卡那、复方新诺明、多西环素、红霉素、阿莫西林和氨苄西林的耐药率介于25%～75%。研究显示，65株韩国分离株对头孢噻呋、阿米卡星敏感，对四环素耐药；148株塞尔维亚分离株对头孢噻呋、恩诺沙星、氟苯尼考敏感，对四环素和链霉素耐药；我国河南地区APP分离株对泰妙菌素、氨苄西林和头孢噻呋钠等6种药物敏感，对替米考星、红霉素、氟苯尼考等20种抗菌药物完全耐药，西南地区APP分离株对阿莫西林、头孢噻肟和青霉素敏感，对氟苯尼考、替米考星和四环素等9种药物耐受[8-10]。至此表明不同国家和地区APP分离株对抗菌药物的感受性存在差异。由于不同地区、不同养猪场，即使同一养猪场在不同时间，其用药方法有所不同，出现因抗生素的选择压力而导致APP对药物的敏感性不同。因此，针对APP分离菌株进行药敏试验以选择合适药物意义显著。此外，本试验源自4头病猪的APP分离株虽鉴定为同一菌株，但4株菌对链霉素、庆大霉素、丁胺卡那、复方新诺明、多西环素、红霉素、阿莫西林和氨苄西林等8种抗生素的感受性有一定差异，这可能是由于抗生素的长期使用，引致环境中抗生素抗性基因（ARGs）丰度增高，而ARGs之间水平基因的不规则转移可加速APP的抗性获得，导致耐药差异性的出现。