益血膏中芍药苷含量测定方法的建立

刘慧星

江西省药品检查员中心，江西 南昌 330006

益血膏由白芍、黄芪、益母草、地黄等十几味中药组成，具有益精血，补肝肾的功效。用于气虚血亏引起的面色萎黄，精神倦怠，头晕目眩，妇女血虚，月经不调，血小板减少，血红蛋白降低［1］。本品中白芍处方量较大，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效［2］。其主要成分芍药苷可通过PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路进一步抑制大鼠系膜细胞增殖和炎症反应并对系膜增殖性肾小球肾炎具有一定的治疗作用［3］，有研究表明白芍总苷可通过抑制炎性因子水平，下调Wnt 和β-catenin mRNA 蛋白的表达，进一步抑制Wnt/β-catenin 信号通路和mTOR/HIF-1α 信号通路，从而减少类风湿性关节炎引起的关节破坏并降低滑膜细胞损伤程度而发挥抗炎作用［4-5］。本品收载于部颁标准（WS3-B-1219-92），该标准中只有性状、鉴别和检查项，未建立含量测定标准，标准偏低难以控制产品质量，因此，本研究旨在建立该品种的HPLC含量测定方法，为完善其质量标准提供参考［6-9］。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器）；SK5200 型超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；分析天平AL104（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

益血膏（江西济民可信药业有限公司），芍药苷（中国药品生物制品检定所批号：110736-201337，含量以94.9%计），乙腈为色谱级，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果［10-12］

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent TC-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈-0.1%磷酸（14∶86）为流动相；流速1.0 mL/min；检测波长为230 nm；理论板数按芍药苷计算应不低于3 000。

2.2 对照品溶液及供试品溶液制备

供试品溶液制备：取益血膏约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声至溶解，取出，放冷，再称定重量，加50%甲醇补足减少的重量，滤过，取续滤液再用0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

对照品溶液制备：精密称取芍药苷对照品11.18 mg 置50 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取2 mL 至10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，再用0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

阴性样品溶液制备：取无白芍药材的益血膏阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各20 μL，注入HPLC 色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果显示芍药苷理论塔板数均高于3 000；供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，芍药苷色谱峰保留时间一致，阴性样品溶液中的其他成分对测定无干扰，结果表明该测定方法专属性较好。见图1。

图1 高效液相色谱图：A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品；1.芍药苷

2.4 线性关系考察

精密称取芍药苷对照品11.18 mg，置50 mL 量瓶中，加含50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得母液。精密吸取母液加50%甲醇制成含芍药苷10.610、21.220、42.439、63.659、106.098 μg/mL的对照品溶液，注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件测定峰面积，以对照品浓度（μg/mL）为横坐标（x），以峰面积积分值（A）为纵坐标（y），绘制标准曲线，得线性方程为y=0.397 91x+0.304 4，r=0.999 9，表明芍药苷在10.610～106.098 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液20 μL，按“2.1”色谱条件进行测定，连续进样6 次，测定峰面积，结果RSD（n=6）为0.4%，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液,分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 注入液相，记录峰面积,结果RSD（n=6）为0.4%。表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取供试品1 g，按照“2.2”项下制备供试品溶液，平行6 份，结果芍药苷平均含量为1.91 mg/g，RSD（n=6）为1.5%。表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量（批号 191001；含量以1.86 mg/g 计）约0.5 g，平行6 份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密吸取芍药苷对照品溶液（浓度：0.085 mg/mL）10 mL，再精密加入50%甲醇40 mL。按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，计算回收率。结果见表1。由表1 可知，平均回收率为100.5%，RSD 为1.8%，表明该方法准确度良好。

表1 回收率试验（n=6）

2.9 含量测定

取10 批益血膏样品，按照“2.1”项下进行测定，其结果在1.79～2.23 mg/g。见表2。

表2 含量测定结果（n=4）

3 讨论

3.1 溶剂的选择

芍药苷是一种蒎烷型单帖类，可溶于甲醇，本研究分别考察了不同的提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇），由于本品为煎膏剂，含有大量的蜂蜜，用70%甲醇为溶剂时样品处理操作困难，故选择50%甲醇为提取溶剂。

3.2 流动相的选择

本研究分别考察了不同的流动相系统（乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾），结果表明后两种流动相的色谱图基线漂移较大，而采用乙腈-0.1%磷酸，基线无干扰且分离度较好。

3.3 波长的选择

本研究对芍药苷对照品进行紫外全波长扫描，结果在231.5 nm 处有最大吸收，参考《中国药典》2020 版一部的白芍含量测定方法，故确定检测波长为230 nm 。

4 结论

本品收载于部颁标准，该标准无含量测定项，难以有效控制产品质量，本研究建立了益血膏中芍药苷的HPLC 含量测定方法，结果表明该方法灵敏，操作简便，结果可靠，能更好地控制益血膏产品质量，也可为益血膏质量标准的提升提供帮助。