十三味疏肝胶囊中马兜铃酸A的检测方法研究

2021-02-14黄晓燕李荣玮曾蒲军梁晟李瑞莲

药品评价 2021年23期

黄晓燕，李荣玮，曾蒲军，梁晟，李瑞莲

湖南省药品检验研究院，湖南长沙 410001

十三味疏肝胶囊由牛黄、人工牛黄、西红花、绿绒蒿、马兜铃等13 味药材加工制成，具有清热利湿、疏肝理脾、化瘀散结的功效,临床上主要用于肝胆湿热、气滞血瘀所致的肋痛、脘胀，急慢性乙型肝炎见上述症候者。现行质量标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-11528（ZD-1528）-2002-2012Z。

近年来关于马兜铃属植物引起肾毒性的临床报道日益增多［1-4］，由于马兜铃酸具有肾毒性和致癌作用，国际癌症研究机构将其确定为I 类致癌物。本品处方中的马兜铃为马兜铃科植物，含有马兜铃酸A等成分。目前尚未见十三味疏肝胶囊中马兜铃酸检测的文献报道,为了保证用药安全性,本研究参考有关文献［5-12］，采用超高效液相色谱（UHPLC）建立了本品中马兜铃酸A的含量测定方法,并采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）对测定结果进行了进一步的验证，以为其质量控制和临床用药安全提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平（METTLER XSE205）；超声仪（昆山市超声仪器有限公司，KQ500DE）；超高效液相色谱仪（Thermo Fisher Ultimate 3000 RS）；液质联用仪（DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA）。

1.2 试药

马兜铃酸A（批号：110746-201611，纯度98.9%），购自中国食品药品检定研究院。甲酸、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。十三味疏肝胶囊样品为市售产品（批号：20170401、20180102-1、20180102-2）；阴性样品按处方自制。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-PDA 法

2.1.1 色谱条件色谱柱为 Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），进样量为1 μL，柱温为30 ℃，流动相为乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70），流速为0.3 mL/min。

2.1.2 供试品溶液的制备取本品内容物适量，研细，混匀，取约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%甲酸-甲醇（20∶80）的混合溶液25 mL，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放凉，再称定重量，用10%甲酸-甲醇（20∶80）的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备精密称取马兜铃酸A 对照品16.85 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（333.293 μg/mL），分别精密量取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成系列浓度对照品溶液（49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL）。

2.1.4 阴性样品溶液制备取按样品同样工艺制备而成的缺马兜铃的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验精密吸取马兜铃酸A 对照品溶液（19.998 μg/mL）、阴性对照溶液与供试品溶液各1 µL，依法进行测定。结果供试品色谱中，在与马兜铃酸A对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而缺马兜铃阴性对照溶液无相应色谱峰，表明处方中其它药味对测定结果无干扰，专属性强，结果见图1。

图1 十三味疏肝胶囊高效液相色谱图

2.1.6 精密度试验精密吸取同一供试品溶液（批号：20180102-1），连续进样6 次，每次5 µL，结果马兜铃酸A 峰面积值RSD 为1.7%，精密度良好。

2.1.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（批号：20180102-1），分别于配制后的0、6、12、16、24 h，精密吸取5 µL，注入液相色谱仪，测定。结果马兜铃酸A 峰面积值RSD 为2.1%，表明供试品溶液在配制后24 h 内基本稳定。

2.1.8 重复性试验取同一批号（批号：20180102-1）样品6 份，依法制备供试品溶液，测定。结果马兜铃酸A的含量为0.12 mg/g（RSD 为1.2%），本方法重复性较好。

2.1.9 加样回收率试验取已知马兜铃酸A 含量（0.12 mg/g）的同一批样品（批号：20180102-1）约0.75 g，共六份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入马兜铃酸A 对照品溶液（0.049 994 mg/mL）2 mL，水浴低温蒸干，参照“2.1.2”项下的制备方法制备供试品溶液，测定并计算，结果见表1。结果马兜铃酸A 平均回收率为93.38%，RSD为1.35%，结果表明本方法加样回收率较好。

表1 马兜铃酸A回收率试验结果（n=6）

2.1.10 线性关系吸取马兜铃酸A 系列对照品溶液（49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL），依法测定。以马兜铃酸A的量为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，结果马兜铃酸A的回归方程为Y=0.161 89X+0.002 73，r=0.999 9，结果表明马兜铃酸A 在1.999～49.994 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.1.11 测定结果取十三味疏肝胶囊样品，照“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，3 批样品均检出马兜铃酸A（批号：20170401，0.11 mg/g；批号：20180102-1，0.12 mg/g；批号：20180102-2，0.12 mg/g）。

2.2 LC-MS 法

2.2.1 色谱条件色谱柱：Welch UHPLC XB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 µm），流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～7 min、30%→60% A，7～12 min、60%→100% A），柱温：35 ℃，进样量：5 µL，流速：0.3 mL/min。

2.2.2 质谱条件 m/z 范围：100～1 000；离子化模式为ESI+，离子传输管温度350 ℃，毛细管电压3.2 kV，干燥气温度350 ℃，碰撞能量10 V，鞘气流速30 Arb，辅助气流量10 Arb，扫描模式为MRM。

2.2.3 对照品溶液的制备取“2.1.3”项下的马兜铃酸A 对照品溶液（1.999 μg/mL），即得。

2.2.4 供试品溶液的制备取“2.1.2”项下的供试品溶液适量，用甲醇稀释10 倍，作为供试品溶液。

2.2.5 测定法精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各5 µL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图，结果见图2。

图2 十三味疏肝胶囊选择离子色谱图

2.3 测定结果

在 UHPLC-PDA 法中3 批样品检出含马兜铃酸A，采用LC-MS 法验证，均检出与对照品相同的分子离子峰及其碎片峰。

3 讨论

3.1 样品制备方法的选择

采用了超声处理、加热回流2 种提取方法，结果二者提取得率基本相当，因超声提取操作简便故选之。分别用甲醇、70%甲醇、10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液各25 mL 超声提取，结果表明，10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液提取的待测成分得率稍高，故选择10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液为提取溶剂。

3.2 流动相的选择

UHPLC-PDA 法测定时，考察了乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70）、甲醇-0.5% 冰醋酸（48∶52）、乙腈-0.1%三氟乙酸（33∶67）、乙腈-0.1%磷酸（33∶67）、乙腈-0.1%甲酸（33∶67）五种流动相的分离效果，结果以乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70）分离效果最好，故选之。

LC-MS/MS 法测定时，考察了10 mmol/L 醋酸铵溶液（氨水调pH 至7.5）-乙腈（75∶25）、0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脱）、含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈（梯度洗脱）三种流动相条件，结果发现，以含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈为流动相，分子离子峰及加和离子峰响应较好，故选之。