LC-MS/MS 法测定大活络丸中血竭素的含量

易徐航，张钰祺，杨恢检

萍乡市食品药品检验所，萍乡 江西 337000

大活络丸是由血竭、麝香、牛黄、乌梢蛇、蕲蛇、两头尖、防风、羌活、全蝎等48 味药材研成细粉，混合均匀加炼蜜制成的丸剂。具有祛风止痛、舒筋活络等功效，临床上常用于中风痰厥引起的瘫痪，足痿痹痛，腰腿疼痛，跌打损伤，胸痹等症状［1］。大活络丸中含有多味传统的名贵中药材，其中，血竭更是被誉为“活血疗伤之良药”。血竭作为处方中的臣药，具有生肌敛疮，活血定痛，化瘀止血之功效［2］，其主要活性成分为血竭素［3］。现代研究表明，血竭素具有活血与止血的双向调节作用［4-7］。目前大活络丸的执行标准多为卫生部药品标准中药成方制剂第六册WS3-B-1082-92［8］，该标准已经执行多年，仅有简单的丸剂通则检查，并不能对其质量进行有效地控制。近年来，高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在中成药中有效成分的含量测定中应用日益广泛［9-10］。本试验采用LC-MS/MS 法测定大活络丸中血竭素的含量，以期为控制和提高大活络丸的质量提供科学依据。

1 材料

1.1 试药

血竭素高氯酸盐对照品（批号：110811-201707，含量：96.3%），购自中国食品药品检定研究院；甲醇（HPLC 级，购于ThermoFisher 公司）；甲酸（HPLC 级，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水。样品信息见表1。

表1 样品信息

1.2 仪器

安捷伦6460 型高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪；CP-225D 型电子天平（十万分之一，SARTORIUS 公司）；ME-204 型电子天平（万分之一，METTLER TOLEDO 公司）；KQ-500DB 型超声仪（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0～3 min，40% A；3～8 min，40% A →100% A；8～10 min，100% A；10～10.5 min，100% A →40% A；10.5～15 min，40% A）；流速0.2 mL/min；柱温为35 ℃；进样量10 μL。血竭素对照品和大活络丸供试品的总离子流色谱图见图1。

图1 总离子流色谱图：A.血竭素对照品；B.供试品

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI）正离子检测，多反应监测（MRM）方式进行扫描。干燥气和雾化器均为高纯氮气，毛细管电压4 000 V；干燥气温度300 ℃；干燥气流量8 L/min；雾化气压力30 psi。选择质荷比（m/z）267.0 →222.9 作为定量离子对，m/z 267.0 →251.0、m/z 267.0 →196.9 作为定性离子对。传输电压（Fragmentor）为135 V，碰撞能量（Collision Energy）为34 V。血竭素对照品和大活络丸供试品的二级质谱见图2。

图2 二级质谱图：C.血竭素对照品；D.供试品

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品储备液的制备 精密称取血竭素高氯酸盐对照品10.66 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得含血竭素74.6 μg/mL的储备溶液（血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量/1.377）［2］。

2.3.2 供试品溶液的制备 取样品大蜜丸2 丸，剪碎，加入等量硅藻土，研匀，取约7 g（相当于1 丸量）置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，4 000 r/min 离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3 阴性样品溶液的制备 按工艺方法制备缺少血竭药材的阴性样品，按“2.3.2”项下方法操作，制成阴性样品溶液，依法测定，结果显示阴性样品的总离子流色谱图中，无呈现与血竭素对照品保留时间相同的色谱峰，见图3。

图3 阴性样品总离子流图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取上述血竭素对照品储备液，加甲醇逐级稀释得系列标准溶液，浓度分别为37.3、74.6、373.0、746.0、1 492.0、3 730.0 ng/mL。按“2.1”“2.2”项下的色谱和质谱条件进行测定，以血竭素对照品的进样浓度（ng/mL）为横坐标（X），相应的峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=328.53X+57 753，r=0.999 8。结果表明，血竭素的进样浓度在37.3～3 730.0 ng/mL 呈良好线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取血竭素对照品溶液（373.0 ng/mL）10 μL，按“2.1”“2.2”项下的色谱和质谱条件连续进样6 针，测定峰面积。血竭素峰面积的RSD 为0.40%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性实验 取同一份大活络丸供试品溶液（编号S1），分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取10 μL 进样，按“2.1”“2.2”项下的色谱和质谱条件，测定血竭素的峰面积，其RSD 为1.28%，结果表明大活络丸供试品溶液在室温下24 h 内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批号（编号S1）样品六份，按“2.3.2”项下方法制备大活络丸供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下的色谱和质谱条件进样测定，计算血竭素的含量（μg/g）。结果计算得血竭素含量的RSD 为1.02%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量（编号S1：3.97 μg/g）的大活络丸样品2 丸，剪碎，加入等量硅藻土，研匀，取约3.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入血竭素对照品溶液（3.73 μg/mL）适量，按“2.3.2”项下方法制备大活络丸加样回收溶液，按“2.1”“2.2”项下的色谱和质谱条件进样测定含量，计算加样回收率。结果表明血竭素的平均回收率为100.09%，RSD 为1.42%，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.4.6 检测限与定量限 取血竭素对照品溶液加甲醇逐级稀释后进样测定，以信噪比3∶1的对照品溶液浓度为检测限（LOD），以信噪比10∶1的对照品溶液浓度为定量限（LOQ）。结果血竭素检测限为1.33 ng/g；定量限为4.00 ng/g。

2.4.7 耐用性试验 取同一批号（编号S1）样品，按“2.3.2”项下方法制备大活络丸供试品溶液，分别选择Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；Waters XBridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；Welch Ultimate XB-C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）3 种品牌的色谱柱，按“2.1”“2.2”项下的色谱和质谱条件测定，结果无明显差别。

2.5 样品测定

取不同厂家的10 批大活络丸（编号S1-10），按“2.3.2”项下方法制备大活络丸供试品溶液。分别精密吸取血竭素对照品溶液与大活络丸供试品溶液各10 μL 注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表3。

表3 大活络丸样品中血竭素含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 紫外与质谱检测器的比较

本文曾采用高效液相紫外检测器对大活络丸中血竭素进行含量测定，由于大活络丸处方庞大，成分复杂，通过优化流动相以及改进提取方式等方法，其样品中的主峰分离效果均不理想，且血竭素在处方中的含量较低，紫外检测器难以满足分析要求。质谱检测器具有专属性强、灵敏度高等［11-12］优势，故本试验建立了LC-MS/MS 法测定大活络丸中血竭素含量的方法。

3.2 流动相的选择

在试验中还考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01 mol/L 醋酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.01 mol/L 醋酸铵溶液等多组流动相体系，结果表明，流动相为甲醇-0.1%甲酸时梯度洗脱能得到较好的峰型和分离度。

3.3 提取方法及时间的考察

本次收集的大活络丸样品均为大蜜丸，采用加入等量的硅藻土研匀的方式，以便于目标成分的溶出。提取条件采用超声提取法分别考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇四种提取溶剂，结果表明甲醇提取效率最高。在此基础上，分别考察了超声和回流2 种提取方式，结果显示超声与回流提取效率相当，故选用提取简便的超声提取方式。同时对甲醇溶液用量10、25、50 mL，以及超声时间10 min、30 min、1 h 进行考察，最后确定采用甲醇超声（500 W，40 kHz）处理30 min 为宜。

3.4 质谱条件的优化

在对质谱条件进行优化时，分别考察了毛细管电压、干燥气温度、干燥气流量和雾化气压力对含量测定的影响，最终确定毛细管电压4 000 V，干燥气温度300 ℃，干燥气流量8 L/min，雾化气压力30 psi 为最优状态。采用ESI 电离模式，分别比较了血竭素在正离子扫描和负离子扫描模式下的响应信号，发现血竭素在正离子化模式下响应值较高。通过全扫模式（Full Scan），确定血竭素的母离子。通过选择单离子检测模式（SIM）和子离子检测模式（Product Ion Scan）对传输电压和碰撞能量等关键参数的优化，以确保定量检测的准确性。

3.5 小结

从对10 批大活络丸中血竭素的含量测定结果来看，血竭素的含量为0.29～7.15 μg/g。不同厂家生产的大活络丸血竭素含量相差较大，提示血竭原药材的质量或厂家的生产工艺存在差异。为避免由原药材或生产工艺引起中成药的疗效差异，建议厂家进一步完善质控标准和生产工艺，确保产品质量的均一性和有效性。本文建立了LC-MS/MS 法测定大活络丸中血竭素含量的方法，经方法学验证，该方法结果准确、快速，重复性好，操作简便，可用于大活络丸中血竭素的含量测定。