无尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量测定研究

葛文辉，赵敏敏,，高燕平，游媛，任琦，蔡靖波

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

植物无尾果（Coluria longifoliaMaxim.）为蔷薇科无尾果属，产于我国西藏、青海、甘肃、云南、四川地区，是我国常用藏药热衮巴药材原植物之一，具有止血止痛、清热作用［1-2］。无尾果植物中含有黄酮类化合物、木脂素类化合物、三萜类化合物、植物甾醇类化合物等，可镇痛、抗炎、解热，用于类风湿性关节炎等疾病的治疗［3-10］。目前，对无尾果的研究报道甚少，且无相关质量标准。本文以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷为指标成分,运用高效液相色谱法对其含量进行测定，建立可用于无尾果内在质量控制的有效方法。

1 材料

1.1 仪器

戴安Ultimate 3000 系列高效液相色谱仪（美国赛默飞公司），Sartorius BP211D 型电子天平（德国赛托利斯集团），ML-204T 电子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 试药

无尾果药材（贵州，批号：20201027、1907139、1907157、20200805、20200806、2020、DY），槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（批号：CFS202101，98%）对照品购自ChemFaces，乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（15∶85）；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。色谱图见图1～3。

图1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品HPLC色谱图

图2 供试品溶液HPLC色谱图

图3 甲醇空白HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的配制 称适量槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀得到对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取无尾果粉末（批号：20201027，过四号筛）约0.25 g，精密称定。取甲醇50 mL，放入锥形瓶内一同称重，在水浴锅上加热回流30 min，冷却后再称重，用相同试剂补重，摇匀后进行过滤，续滤液为供试品溶液。

2.2.3 空白样品溶液 取甲醇溶液作为空白样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 用十万分之一天平精密称取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品8.66 mg，置10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即为对照品溶液的母液。再将母液稀释14 倍后制成稀释液，按以上色谱条件分别吸取稀释液1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，12 μL 进行峰面积的测定。以吸取量X（μg）为横坐标，对应的峰面积Y 为纵坐标，绘制槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷标准曲线，得回归方程式：Y=1 064.9X+1.545 5，r=0.999 7，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷在0.061 9～0.742 3 μg 之间线性关系良好。对照品标准曲线见图4。

图4 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷标准曲线

2.3.2 重复性试验 批号相同的无尾果样品取6 份，每份重约0.5 g，通过以上相同的制备方法和色谱条件得到6份无尾果供试品溶液并对其分别进行测定，计算无尾果中黄酮苷类成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量的RSD 为0.6%。说明无尾果样品按此法进行试验，有良好重复性。

2.3.3 耐用性试验 将无尾果重复性试验其中的2 份供试品溶液，用SVEA、YMC、资生堂三种不同品牌的C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱按以上色谱条件分别进行测定。结果发现三种品牌C18 色谱柱的测定结果并无明显差异。

2.3.4 精密度试验 根据以上色谱条件将无尾果药材的供试品溶液持续6 次取样，每次10 μL，对其峰面积进行测定，计算RSD 为0.43%。

2.3.5 稳定性试验 在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h不同时间内，分别吸取同份无尾果药材的供试品溶液10 μL，记录槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的峰面积，得其峰面积的RSD=0.23%，表明24 h 内供试品溶液稳定。

2.3.6 回收率试验 取已知含量的无尾果药材粉末（过四号筛）6 份，每份约0.125 g，精密称定。加入槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品1.5 mg，按以上制备方法和色谱条件得无尾果供试品溶液并对其进行含量测定，计算槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的回收率。结果显示其平均回收率（n=6）为101.5%，RSD 为2.0%，回收率试验结果见表1。

表1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷回收率试验结果

2.4 样品含量测定

按以上制备方法和色谱条件得到不同批次无尾果药材的供试品溶液，并且分别进行峰面积测定，根据测定数据计算出无尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量，测定结果见表2。

表2 无尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量

3 讨论

3.1 检测波长的确定

取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品溶液，空白为甲醇溶液，紫外吸收波长在200～400 nm 范围内对槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷进行扫描，发现最大吸收波长为353 nm，参照文献报道选择360 nm，结合样品360 nm 波长下杂峰对目标峰无干扰且稳定，故以360 nm 作为检测波长。

3.2 提取方法的考察

取样品粉末（批号为：20201027）2 份，各约0.25 g，放入锥形瓶，用胖肚吸管量取50 mL 甲醇，置瓶中，将其进行称重，分别用超声（功率250 W，频率25 kHz）和加热回流2 种不同的提取方法，时间均为30 min，取出放冷后再次称重，缺少的重量滴加甲醇补足，摇匀后进行过滤，供试品溶液为续滤液。采用以上色谱条件，发现加热回流提取方法所得溶液的槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量较超声提取方法高，故选择加热回流提取方法。

3.3 溶剂用量考察

取同一批样品3 份，各约0.25 g，倒入锥形瓶，用胖肚吸管分别吸取25 mL、50 mL、75 mL 纯甲醇至锥形瓶中，称重，均加热回流30 min，取出放冷后再次称重，纯甲醇补重，震荡均匀后过滤，供试品溶液为续滤液，根据以上色谱条件测定。结果表明，加入甲醇50 mL 和75 mL 提取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸无明显差异，故选择提取溶剂用量为50 mL。

3.4 提取溶剂的考察

取同一批样品3 份，各约0.25 g，放入4 个锥形瓶内，分别用胖肚吸管取乙醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇50 mL，加入到锥形瓶，称重，回流提取30 min，取出放冷后再次称重，分别用相对应浓度的试剂进行补重，震荡后过滤，取其续滤液为供试品溶液。采用以上色谱条件，分别进行测定。发现使用70%甲醇的无尾果样品提取率最高，故以70%甲醇为提取溶剂。

3.5 提取时间的考察

取同一批样品4 份，各约0.25 g，放入4 个锥形瓶内，用胖肚吸管取70%的甲醇50 mL，加入到锥形瓶一同称重，分别加热回流20 min、30 min、60 min、90 min，取出放冷后再次称重，滴加70%甲醇，补重后震荡，混匀后过滤，供试品溶液为续滤液，按以上色谱条件测定。结果表明：30 min 后随着回流时间增加，含量基本不变，故选择提取时间为30 min。

3.6 方法评价

根据7 批样品含量测定结果的差异性可得，建立的无尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量测定方法，具有简便、准确可靠、稳定性及重复性良好的优点，能较好地控制其内在质量，为无尾果的质量控制提供参考依据。