壮腰健身丸UPLC 指纹图谱及化学模式识别

喻何云，任琦，丁银平，赵敏敏,2，付辉政，游媛

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

壮腰健身丸由女贞子（酒蒸）、金樱子、千斤拔、黄精、狗脊、熟地黄、制何首乌七味药材组成，具有壮腰健身的功效，临床上广泛用于腰腿酸软，心悸眼花，耳鸣头晕，阳萎遗精等治疗［1］。壮腰健身丸现行标准收载于《中国药典》2020 版一部。目前，其质量控制研究停留在HPLC 法测定特女贞苷单一成分的含量，检测指标少，难以有效控制壮腰健身丸的整体质量。由于壮腰健身丸成分复杂多样性，临床用药时需各成分相互协同才能达到治疗效果，但现行标准难以控制产品质量，无法保证产品工艺的稳定性与均一性。目前针对其质量分析，仅有壮腰健身丸质量标准研究［2］及微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定壮腰健身丸中的重金属及有害元素［3］的报道，未见国内外有关壮腰健身丸指纹图谱的研究报道。

中药指纹图谱［4-6］能够反应中药活性成分整体特性，具有分析速度快、专属性强、重现性好等特点。化学模式识别［7-9］能够将指纹图谱的多维信息进行处理、综合分析评估，全面客观地反映中药的整体信息，对其质量控制及质量评价研究起到重要的作用。故本研究建立了壮腰健身丸UPLC 指纹图谱，同时进行相似度评价，并结合聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析3 种化学模式识别分析方法对其进行质量评价研究［10-18］，旨在为全面控制及评价壮腰健身丸提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity（DAD）型超高效液相色谱仪（美国Agilent 科技有限公司）；Milli-Q Direct 16 超纯水仪（德国Millipore 中国有限公司）；Sartorius BT 25 S 型十万分之一天平（德国Sartorius 公司）；Sartorius BSA 124S-CW 型万分之一天平（德国Sartorius 公司）。

1.2 试药

红景天苷（批号：110818-200404）；2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号：110844-201109）；特女贞苷（批号：111926-201102）；染料木素（批号：111704-201703）；大黄素（批号：110756-201512）；大黄素甲醚（批号：110758-201616），以上均购自中国食品药品检定研究院。女贞子（酒蒸）、黄精、熟地黄、金樱子、狗脊、制何首乌、千斤拔七味药材均由江西九华药业有限公司提供，经江西省药品检验检测研究院付辉政主任鉴定为正品。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他为分析纯。11 批壮腰健身丸分别来自江西九华药业有限公司（批号：190101、190102、190301、160102、160302、160603、180701、180702、180901、180902）、江西半边天药业有限公司（批号：20160701）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），进行梯度洗脱（0～20 min，5%～90% A；20～25 min，90% A）；检测波长为波长转换（0～4.1 min，320 nm；4.1～4.8 min，254 nm；4.8～7.0 min，224 nm；7.0～11.0 min，320 nm；11.0～16.0 min，254 nm；16.0～19.0 min，320 nm；19.0～25.0 min，288 nm）；柱温为40 ℃；流速为0.2 mL/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取红景天苷对照品、2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品、特女贞苷对照品、大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 各含红景天苷15 μg、2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷12 μg、特女贞苷60 μg、大黄素7 μg的混合溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，剪碎，混匀，取约2 g，精密称定，精密加80%甲醇50 mL，置具塞锥形瓶中，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 单味药材溶液的制备 取女贞子（酒蒸）、黄精、熟地黄、金樱子、狗脊、制何首乌、千斤拔七味药材，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品（批号：180901），按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，测定，记录各色谱峰保留时间和积分峰面积。以8 号色谱峰（特女贞苷）为参照峰（S），计算各色谱峰的相对保留时间RSD＜1.00%，相对峰面积RSD＜5.00%，图谱相互间相似度均大于0.90，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取样品（批号：180901）6 份，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各色谱峰保留时间和峰面积。以8 号色谱峰（特女贞苷）为参照峰（S），计算各色谱峰的相对保留时间RSD＜1.00%，相对峰面积RSD＜5.00%，图谱相互间相似度均大于0.90，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取样品（批号：180901）1 份，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h 测定指纹图谱，记录各色谱峰保留时间和峰面积。以8 号色谱峰（特女贞苷）为参照峰（S），计算各色谱峰的相对保留时间RSD＜1.00%，相对峰面积RSD＜5.00%，图谱相互间相似度均大于0.90，表明该供试品溶液至少在24 h 内稳定。

2.4 指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立 取11 批壮腰健身丸样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录。将得到的数据导入2012 版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，选取“时间窗宽度”为0.10 min，对照图谱的生成方法为“中位数”，自动匹配后，得到对照图谱，见图1，共确定15 个共有峰。

图1 壮腰健身丸的对照指纹图谱

2.4.2 共有峰的指认、归属及参照峰的选择 取“2.2”项下的制备的3 种溶液，分别按“2.1”项下色谱条件测定，结果见图2。采用对照品保留时间及紫外光谱图指认出6 个特征峰，分别是4 号峰红景天苷，6 号峰2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，8 号峰特女贞苷，12 号峰染料木素，13 号峰大黄素，15 号峰大黄素甲醚。将供试品与药材色谱图进行对比，归属了15 个共有峰，女贞子（酒蒸）提供了4、5、7、8、10 号峰；金樱子提供了9 号峰；千斤拔提供了12、14 号峰；黄精提供了1 号峰；熟地黄提供了1、2、3、11 号峰；制何首乌提供了6、13、15 号峰。其中8 号峰为女贞子（酒蒸）的特征成分，该峰保留时间适中、吸收强、分离度好，故将其作为参照峰，见图2。

图2 色谱峰指认及归属

2.4.3 相似度评价 将11 批壮腰健身丸的数据导入2012 版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，计算样品与对照指纹图谱之间的相似度，结果分别为1.000、0.999、0.994、0.811、0.837、0.803、0.855、0.851、0.936、0.906、0.720。结果表明，11 批次样品相似度有4 批次样品低于0.850。

2.5 化学模式识别

2.5.1 聚类分析（CA）将11 批壮腰健身丸样品的15 个共有峰的峰面积相对于称样量量化后进行标准化处理，组成11×15 阶原始矩阵，运用IBM SPSS Statistics 23.0 软件，以组间联接为聚类方法，测量度采用平方欧氏距离，进行系统聚类分析，CA 树状图见图3。结果显示，当欧氏距离为10 时，11批样品可分为3 类：Ⅰ类：S1～S3，相似度均大于0.990；Ⅱ类：S4～S10 相似度均大于0.800；Ⅲ类：S11。此结果与相似度评价结果一致。

图3 11批壮腰健身丸聚类分析结果

2.5.2 主成分分析（PCA）用IBM SPSS Statistics 23.0软件对量化的各共有峰峰面积进行标准化处理后，对11 批壮腰健身丸进行主成分分析，计算相关系数矩阵的特征值及其方差贡献率。提取3 个主成分（特征值＞1），其累计方差贡献率为89.915%，可代表指纹图谱共有峰的大部分信息。利用SIMCA 14.1软件绘制主成分散点得分图，见图4。结果显示11批壮腰健身丸可分为3 类，与聚类分析结果一致。

图4 11批壮腰健身丸主成分分析散点得分图

2.5.3 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）为进一步筛选出贡献较大的成分，本研究在主成分分析的基础上，采用SIMCA 14.1 软件建立OPLS-DA 模型，结果X 矩阵结实率参数R2X 为0.843，模型稳定性参数R2Y 为1，模型预测能力参数Q2为0.869，均大于0.5，且R2和Q2两者差距均小于0.2，说明所建模型解释率、稳定性和预测性均较强。经OPLS-DA 模型拟合分析，得到11 批供试品的得分散点图，见图5。为验证所建OPLS-DA 模型是否存在过度拟合，将分类矩阵变量参数设定随机排列200 次做置换检验，见图6。结果R2和Q2拟合线在Y 坐标轴的截距分别为0.129（应小于0.3）和-0.761（应小于0.05），表明该模型不存在过度拟合现象，结果可靠。

图5 11批壮腰健身丸OPLS-DA得分图

图6 11批壮腰健身丸OPLS-DA置换检验图

VIP 图可直观体现影响样品组间差异的差异性成分，VIP＞1 即为质量差异标志性成分，见图7。结果峰6（2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷）、峰3、峰2、峰8（特女贞苷）的VIP 值均大于1，为壮腰健身丸的质量差异标志性成分。建议企业在生产过程中，应着重关注这些成分，并建立相应的质量控制体系，以提高产品的均一性及稳定性。

图7 11批壮腰健身丸OPLS-DA VIP 图

3 讨论

3.1 色谱条件的考察

本实验分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%醋酸溶液、乙腈-水不同比例梯度洗脱流动相系统，不同流速（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/min），不同柱温（25、30、35、40、45 ℃），不同进样量（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL）对分析结果的影响。综合分离效果、色谱峰的峰形，采用甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脱、0.2 mL/min 流速、40 ℃柱温、2.0 μL 进样量的色谱条件作为壮腰健身丸指纹图谱分析条件。

3.2 结果分析

指纹图谱相似度评价结果表明，11 批次样品相似度有4 批次样品低于0.85，说明不同生产企业的生产工艺差异性较大，且同一生产企业生产的样品间差异性也较大。分析原因可能与工艺（粉碎程度及消毒方式）、原药材（质量优劣）、投料（少投料）等因素有关。本试验采用了CA、PCA 及OPLS-DA 3 种化学识别模式分析方法，将样品分成了3 类，并筛选到了4 个质量差异标志性成分，分别为峰6（2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）、峰3、峰2、峰8（特女贞苷）。通过单味药材对照实验，最终确定6 号峰来自制何首乌，3号峰及2 号峰均来自熟地黄，8 号峰来自女贞子（酒蒸）。提示生产企业在生产制备过程中应重点关注上述4 个成分的含量变化以及原药材制何首乌、熟地黄、女贞子（酒蒸）的质量优劣情况。

4 结论

本试验建立了壮腰健身丸UPLC 指纹图谱，并结合CA、PCA 及OPLS-DA 化学模式识别技术对其质量进行综合评价，该分析方法专属性强、重现性好、分析速度快，为科学、有效、快速地控制及评价壮腰健身丸质量提供参考依据。