线粒体糖尿病家系MT-TL1基因m.3243A>G突变1例临床特征分析

杨 玉，吴贵员，黄 慧，陈 卡，熊 婷

(江西省儿童医院、南昌大学附属儿童医院a.内分泌遗传代谢科;b.中心实验室，南昌330006)

线粒体糖尿病(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)是一组由于线粒体呼吸链和氧化磷酸化系统功能障碍引起的临床异质性疾病，属于特殊类型糖尿病，线粒体DNA MT-TL1基因m.3243A>G突变是其最常见的原因，因其具有母系遗传特征且多伴耳聋故又称为母系遗传糖尿病伴耳聋(maternally inherited diabetes and deafness，MIDD)[1]。多系统损害是MDM的临床特征[2]，通常包括脑、肝脏、骨骼肌、内分泌腺和心脏在内的依赖能量高的器官都会受到影响。本文通过以下标准筛选线粒体糖尿病家系，分析家系成员临床表型特征及基因突变情况，为临床早期诊断以及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 病例筛查

对江西省儿童医院内分泌遗传代谢科2016年1月至2019年12月收治的161例糖尿病患儿进行筛选，筛选标准：1)按相关标准[3]确诊为糖尿病[3]；2)年龄<16岁；3)合并多系统损伤(多系统是指等于或大于3个系统)；4)具有明显的母系遗传特征。本研究经过伦理委员会批准，征得患儿监护人及其他家系成员知情同意。

1.2 先证者病例资料

161例糖尿病患儿中筛查出疑似母系遗传糖尿病家系1例。先证者，女，13岁8个月，反复尿糖、尿蛋白阳性1周入院。现病史：患儿近13年生长缓慢，生长速率不详。运动和智力发育落后，无听力、嗅觉障碍，无其他慢性疾病等，多次尿常规提示“尿糖、尿蛋白阳性”。精神可，食纳欠佳，睡眠好，大小便正常。既往史：12岁时因阑尾炎行阑尾切除术，曾有“外阴炎”病史，眼科体检异常(具体不详)。个人史：G2P1，胎龄30周，剖宫产，无产时缺氧窒息史。出生体重2 kg，身长不详，人工喂养，生长发育较同龄儿落后，2年前初潮。家族史：父亲健康，母亲、外婆、舅舅均患糖尿病，外公、阿姨、妹妹目前身体健康，均否认近亲结婚。

体格检查：身高135 cm(-3.9SDS，SDS：标准偏差分数)，坐高72 cm，体重29 kg(-2.58SDS)，BMI15.9 kg·m-2，血压102/65 mmHg(1 mmHg=1.33 kPa)。身材匀称，皮肤偏黑，无水肿，双上臂及背部毳毛多(F-G评分6分)，后发际线低，心、肺、腹部、脊柱、四肢无异常，肾区无叩击痛，神经征(-)，双乳房B4，腋毛A1，阴毛PH1。

辅助检查：24 h尿蛋白86 mg·24 h-1(3.2 mg·24 h-1)，尿微量白蛋白58.06 mg·L-1(0～30 mg·L-1)，葡萄糖口服耐量试验2 h血糖 9.29 mmol·L-1(<11.1 mmol·L-1)，HbA1c 5.50%，谷氨酸脱羧酶抗体和抗人胰岛素抗体阴性。血气分析提示代谢性酸中毒，血乳酸 4.5 mmol·L-1↑(正常值0.7～2.1 mmol·L-1)，血氨 38 μmol·L-1(正常值18～72 μmol·L-1)。血常规、肝肾功能、血脂、甲功五项、皮质醇、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-3均正常。性激素：黄体生成素(LH)9.90 mU·mL-1，卵泡刺激素(FSH)5.32 mU·mL-1，孕酮(P)0.29 ng·mL-1，雌二醇(E2)249.74 pg·mL-1，泌乳素(PRL)12.33 ng·mL-1，睾酮(T)42.08 ng·dL-1。血串联质谱正常。染色体：46，XX。腹部彩超未及明显异常。骨龄(G-P法)：10岁。心电图正常。

1.3 家系其他成员的病史资料

先证者外公，男，72岁，身高165 cm(-1.26SDS)，体重63 kg(+0.22SDS)，BMI 23.2 kg·m-2，有高血压病史，在予以降血压药物治疗(具体药物不详)。

先证者外婆，女，70岁，身高144 cm(-3SDS)，体重34 kg(-3.2SDS)，BMI 16.5 kg·m-2。58岁出现双侧听力障碍，伴左侧偏盲，65岁诊断糖尿病，偶有左侧偏头痛，在当地医院检测有乳酸酸中毒，现予以口服降糖药(具体药物不详)治疗，血糖控制良好。

先证者舅舅，男，40岁，身高156 cm(-2.7SDS)，体重37.7 kg(-3.05SDS)，BMI 15.5 kg·m-2。28岁诊断糖尿病，30岁出现双侧耳鸣、听力下降和双眼视力减低，晨起经常神志恍惚，在当地医院检测有乳酸酸中毒，现予以胰岛素皮下注射治疗，血糖控制良好。

先证者阿姨，女，36岁，身高152 cm(-1.59SDS)，体重40 kg(-2SDS)，BMI 17.3 kg·m-2，目前身体健康。

先证者父亲，男，42岁，身高170 cm(-0.44SDS)，体重67.3 kg(+0.5SDS)，BMI 23.3 kg·m-2，目前身体健康。

先证者母亲，女，35岁，身高148 cm(-2.3SDS)，体重34 kg(-3.1SDS)，BMI 15.6 kg·m-2。20岁诊断糖尿病，26岁出现双侧听力障碍，伴双侧视力下降，平时经常有中上腹疼痛，在当地医院检测有乳酸酸中毒，现予以胰岛素皮下注射治疗，血糖控制良好。

先证者妹妹，女，12岁，身高136 cm(-2.56SDS)，体重30 kg(-1.3SDS)，BMI 16.2 kg·m-2，智力落后，学习能力成绩差，余无不适。

1.4 线粒体DNA MT-TL1基因检测

采集先证者及其家系成员的外周血3 mL。按照试剂盒说明书提取DNA(北京，TIANGEN)，设计MT-TL1 3243位点筛查引物：mtDNA3243-F1：5′-TTGGATCAGGACATCCCGATGGTGCAG-3′，mtDNA3243-R1：5′-GTTTTAGGGGCTCTTTGGTGAAGAGT-3′，配制20 μL PCR反应体系，扩增条件为：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、退火 1 min、72 ℃ 1 min、35个循环，72 ℃ 10 min。将PCR产物适量加入提前配置好的2%琼脂糖凝胶，置于电泳槽中，120 V恒压电泳30 min后，摄像并观察电泳条带。

ApaⅠ酶切PCR产物鉴定家系成员MT-TL1基因m.3243A>G点突变。取所得PCR反应产物各50 μL，送上海生工基因公司检测MT-TL1基因。

2 结果

2.1 ApaⅠ酶切电泳结果

线粒体基因PCR产物经ApaI酶切后，含有m.3243A>G点突变的基因会被切成两条片段，在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳中显影两条带，而不含该位点突变的野生型基因不会被酶切，在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳中显影一条带。如图1所示，先证者及其外婆、舅舅，母亲、小姨、妹妹的线粒体基因提示存在突变。

0:未酶切；1：酶切后；a：舅舅；b：父亲；c：母亲；d：妹妹；e：外公；f：外婆；g：小姨；h：先证者。

2.2 基因测序结果

先证者及其外婆、舅舅、小姨和母亲存在MT-TL1基因m.3243A>G点突变(图2红箭头所示)。

有线粒体3243A>G点突变：Ⅰ2为先证者外婆，Ⅱ1为先证者舅舅，Ⅱ2为先证者小姨，Ⅱ3为先证者母亲，Ⅲ1为先证者；无线粒体3243A>G点突变：Ⅰ1为先证者外公，Ⅱ4为先证者父亲，Ⅲ2为先证者妹妹。

2.3 该家系成员的主要临床特征

该家系共3代，母系成员有6人，4人患病，分别为先证者及其外婆、舅舅、母亲。先证者Ⅲ1诊断为糖耐量受损；其外婆、舅舅、母亲诊断为糖尿病。

主要临床特征为身材矮小5人(83.3%)，听力障碍3人(50%)，视力受损4人(66.7%)，智力落后2人(33.6%)，乳酸酸中毒4人(66.7%)；其他表现为肾脏损伤、胃肠道症状、偏头痛、运动发育落后、肾脏损伤、间断性神志不清各1人。详见表1。

表1 该家系6位母系成员主要临床特征

2.4 家系图谱

该家系图谱如图3，显示先证者家系具有明显的母系遗传特征，三代人中共有5人携带突变基因，4人发病。

图3 家系图谱

3 讨论

MDM即MIDD属于线粒体疾病，它是由线粒体DNA(mtDNA)基因突变引起的一类疾病，最常见突变类型为m.3243A>G 点突变。由于基因突变，线粒体氧化磷酸化基因的翻译过程出现异常，造成ATP合成减少；突变致高毒性OH-物质增多，引起DNA破坏，都可能是致病的原因[4]，最终发生相关的多种临床表型。

3.1 MDM的临床特征

MDM的临床特征有：1)呈母系遗传特征，女性患者子代几乎都携带此突变基因，但不一定都患病，男性患者后代一般不携带此突变基因；2)糖尿病发病年龄大部分在40岁之前，大部分发病于成年期，青少年发病少见；3)大多数患者的体形正常或偏瘦，平均BMI小于20 kg·m-2[5]；4)胰岛自身抗体检测大部分为阴性；5)糖代谢异常合并多系统损伤表现，如身材矮小、听力异常、视力下降、肾病、肌病、线粒体脑肌病、心肌病等[6]。

身材矮小在线粒体疾病患者中很常见[7]，下丘脑-垂体轴功能障碍被认为是其发病机制，已有报道证实生长激素治疗能够有效地改善一些患者的身高且没有明显不良反应。在患者中，有75%是感觉神经性听力损失[8]，其机制是由于ATP生成减少可能导致纹状血管内离子浓度失衡和细胞死亡，从而造成声音传导减少。最常见眼科特征是典型的黄斑部视网膜营养不良[9]，大多数黄斑疾病患者都呈现糖尿病病史>5年且年龄>40岁，有人认为该症状是由于多元醇途径降低了葡萄糖代谢，异常的葡萄糖耐量增加了色素性视网膜病变的临床表达。患者的晚期肾功能衰竭患病率很高，甚至可能是m.3243 A>G点突变的唯一表现[10]。患者的肌病通常累及四肢近端肌肉，表现为运动引起的肌肉痉挛或无力[11]。神经系统损伤的患病率为10%～27%，而且大部分都是轴突感觉运动神经病[12]。已报道的精神疾病，包括反复发作的严重抑郁症、精神分裂症和各种恐惧症。胃肠道不适也非常常见，尤其是便秘和假性阻塞[13]，且已证明在这些患者的胃体黏膜中积累了更高水平的m.3243A>G点突变[14]。本研究可见该家系先证者目前主要临床特征为糖耐量受损、身材矮小、视力受损、智力发育落后、乳酸酸中毒和肾脏损伤等，虽暂无听力异常的表现，但需定期监测听力情况；先证者外婆、母亲以及舅舅表现有糖尿病、听力下降及视力受损等，可见该家系的主要表现符合该病的临床特征。

3.2 MDM的诊断

随着二代测序技术的成熟和普及，线粒体基因组测序和异质性分析容易进行。血液来源的DNA已被广泛用作多种常见mtDNA突变(例如m.3243A>G点突变)的筛选和诊断工具。但血液中的白细胞异质性低，特别是随年龄增加异质性更低，容易出现假阴性。与血液白细胞相比，尿中脱落细胞mtDNA的异质分析准确性更高。肌肉通常具有最高的异质水平，但在临床工作中较难取样[15]。口腔黏膜细胞更易于进行基因诊断，因为它们易于采样，并且与血液相比通常具有高于30%～50%的异质性值[16]。因此，选择合适的检测样本对线粒体疾病的诊断至关重要，当临床考虑线粒体糖尿病时，可采用不同样本进行检测以提高检出率。该研究通过采集家系成员的血液样本进行基因检测发现先证者及其外婆、母亲、舅舅、阿姨均携带m.3243A>G点突变，虽然先证者妹妹基因检测结果为阴性，但可能由于样本的异质性表现为假阴性，故后期可采集不同样本进行再分析。

3.3 MDM的治疗

线粒体糖尿病的降血糖治疗应个体化，包括一般治疗：尽量避免诱发因素，如感染、过度劳累等；饮食上可不必太严格限制；还可进行抗性训练和耐力训练等。药物治疗：1)降糖药物治疗，应避免使用二甲双胍药物治疗[17]；磺脲类药物及近年来上市的新型降糖药物可用于控制线粒体糖尿病的血糖[18]。2)针对其他系统的药物治疗以及线粒体功能的药物治疗。此外，目前还有一些基因治疗的方法，但仍待进一步的研究。同时，线粒体糖尿病家系的遗传咨询也非常重要，这有助于无症状患者得到早期的诊断和并发症的预防。本研究家系成员中有2人使用胰岛素进行治疗，1人口服降糖药物治疗，先证者目前诊断为糖耐量受损，暂未使用药物治疗。

通过本研究，发现母系遗传线粒体糖尿病家系1例。该家系成员的主要表现为身材矮小、听力障碍、视力受损、智力落后合并乳酸酸中毒，符合该病的临床特征。经线粒体基因测序证实，该家系成员中有5人携带线粒体基因MT-TL1 3243A>G点突变，分别为先证者及其外婆、舅舅、小姨和母亲；共4人发病，分别为先证者及其外婆、舅舅和母亲，说明即使携带突变基因，但不一定患病。虽然本研究Ⅲ2基因检测结果为阴性，但鉴于不同样本的异质性不同，血液样本检测结果可能呈现假阴性。该家系成员的治疗主要是口服降糖药及胰岛素注射进行降糖治疗，先证者目前诊断糖耐量受损，故暂未予药物治疗，但需要密切监测。

综上可见，通过详细分析糖尿病患者的临床特征、体格检查、家族遗传病史，并结合线粒体基因检测，能够为线粒体糖尿病的诊断及个体化治疗提供依据，从而延缓并发症的发生。