木香-砂仁药对治疗功能性消化不良的分子机制探讨

李佳容，缪顺莉，赵舷宏，邓海霞，陈更新

(广州中医药大学a.第二临床医学院，广州 510405；b.第二附属医院脾胃病科，广州 510120)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是指源于胃十二指肠区域的，以餐后饱胀不适、早饱感、上腹痛或上腹烧灼感为特征症状，且经检查排除可引起这些症状的器质性、全身性或代谢性疾病的临床症候群，是临床常见的功能性胃肠疾病[1]。据流行病学研究[2]报道，FD的全球综合患病率为21.8%。因其病情反复的特点，FD对患者的生活质量及社会经济造成了较大的影响[3]。FD的病因和发病机制尚未完全阐明，目前认为可能与胃肠运动功能障碍、胃肠激素异常、内脏高敏感性、精神心理因素、幽门螺杆菌感染及饮食等相关[4]。治疗上，西医以抑酸、促胃肠动力、根除幽门螺杆菌、调节饮食等对症治疗为主，虽有一定疗效，但复发率高[5]。

根据FD的症状表现，将其归属于中医学“痞满”“胃脘痛”“积滞”等范畴，祖国医学在治疗FD上也展现出了不良反应小、疗效显著的优势[6]。木香-砂仁是《古今名医方论》中香砂六君子汤的经典药对，二药相配行三焦之滞气，畅脘腹之膹郁，临床上此二者常用于治疗脘腹胀满、食积不消等症。现代众多医家认为，FD患者以脾胃气虚型者居多，治疗上多以健脾理气为主，常用方剂有香砂六君子汤、香砂平胃散等[7]。木香-砂仁作为香砂六君子汤等方剂中的重要药对，在治疗功能性消化不良中发挥关键作用[8]。现代药理研究[9]提示，木香不仅具有促进胃动力作用，还可以发挥抗病原微生物的作用，例如抑制幽门螺杆菌的生长。砂仁也被证实有助于促进胃排空和胃蠕动[10]。目前关于木香-砂仁药对治疗功能性消化不良分子机制的相关研究较少，需进一步探索木香-砂仁药对发挥作用的物质，从系统的角度了解其作用机制。

网络药理学通过多学科的交叉应用和整体生物网络的分析与再整合，可以揭示药物与作用靶点间的相互关系，阐释中药活性成分间协同作用的机制[11]。在计算机模拟药物设计的过程中，分子对接逐渐发展为一种重要手段。分子对接技术主要用于研究配体与受体间的相互作用，预测其结合方式及亲合力的一种理论模拟方法[12]。本研究通过网络药理学的方法探讨木香-砂仁药对治疗功能性消化不良的作用机制，构建“单位药-活性成分-作用靶点”网络，并进行通路富集分析；运用分子对接软件对化合物、靶点进行分子对接，探讨活性成分与靶蛋白的结合能力和结合模式，为临床应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 木香-砂仁药对相关信息的收集与整理

木香、砂仁的药物成分信息从TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)、ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)数据库中检索获得。TCMSP以OB(口服生物利用度)≥20%和DL(类药性)≥0.10作为筛选原则获取中药化学成分；整合从ETCM、TCMID中获得的药物活性成分信息，同时获取成分对应的PubChem CID，去除重复项。并根据已发表的文献补充化合物。最后，再通过是否满足类药性五原则对收集到的所有成分进行筛选得到最终结果。将符合条件的化合物通过PubChem(https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行确证，得到其对应的SMILES。把从PubChem数据库中获得的化合物SMILES导入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库中进行交叉验证，将物种设置为人类，检索出化合物的潜在靶点信息。

1.2 疾病靶点的获取

与FD相关的人类基因从OMIM(https://www.omim.org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)在线数据平台中得到。以“functional dyspepsia”“dyspepsia”“gastrointestinal disorders”“indigestion”作为关键词，在3个数据库中分别进行检索及筛选。最后将GeneCards数据库中Relevance score≥20的纳入此次研究，整合3个数据库的信息，去除重复基因和假基因，得到与FD相关的靶点信息。

1.3 获取木香-砂仁药对和FD的交集靶点

使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)线上作图工具，将药物潜在靶点和疾病相关靶点导入该平台，进行匹配和映射，并绘制韦恩图，获得两者的交集靶点。

1.4 构建蛋白相互作用网络

将“1.3”中得到的交集靶点数据输入string数据库(https://string-db.org/)，将研究物种设置为人类，获得交集靶点的蛋白相互作用关系，把结果以TSV文件导出。将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化，设置节点大小对应degree的大小，获得最终的蛋白相互作用网络。

1.5 构建“药物-活性成分-作用靶点”网络

整理交集靶点、药物活性成分和药物之间的关系，把信息汇总生成网络图准备文件，其中包括节点间的关系文件和节点属性文件，将它们导入Cytoscape中，构建“药物-活性成分-作用靶点”网络图，并对该网络进行拓扑学分析。

1.6 关键靶点基因本体(GO)富集分析和基因相互作用(KEGG)通路分析

利用Bioconductor平台(http://www.bioconductor.org)和R语言对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集结果包括生物过程(biological process)、分子功能(molecular function)、细胞组分(cellular component)3个部分，将各部分中P值排名最小的前10个terms绘制柱状图展示结果。通路富集分析，以P<0.05作为筛选条件，将P值排名最小的前20条结果通过气泡图进行可视化。

1.7 潜在活性成分-靶蛋白分子对接

为了进一步验证靶点预测结果的可靠性，了解活性成分与靶蛋白的结合方式，对“药物-活性成分-作用靶点”网络中degree值排名较高的化合物及部分靶点进行分子对接验证。通过PubChem(https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得化合物的3D结构的SDF文件，通过OpenBabel3.0软件将其转换为mol2文件格式。通过sailvina2.0软件将化合物批量进行加氢、加电荷、能量最小化等处理，并保存为pdbqt格式文件。通过PDB数据库(http://www.rcsb.org/)找到相应靶点的PDB ID，并下载pdb文件，运用Pymol2.5软件对靶蛋白进行去水、提取化合物等处理，通过插件获取对接盒子参数，保存为pdb后缀的文件。运用AutodockTools软件给靶蛋白加氢、加电荷，转成pdbqt文件。使用Vina对化合物和靶蛋白进行对接。结合能<0 kcal·mol-1说明可以自发结合，结合能的负绝对值越大，说明配体与受体的对接亲合力越大，同时也说明小分子与受体结合的活性越高。把对接结果较好的靶蛋白和化合物通过Pymol进行结合方式展现。

2 结果

2.1 木香砂仁药对的活性成分和潜在靶点

通过搜索及筛选得到木香活性成分72个，砂仁43个；木香活性成分作用的潜在靶点320个，砂仁185个。

2.2 木香砂仁药对和FD的交集靶点

汇总检索结果后，GeneCards数据库以Relevance score≥20为筛选原则可获得782个与FD相关基因；OMIM数据库获得635个；TTD数据库获得4个。将3个数据库信息进行整合去重，最终得到1355个疾病相关基因。将木香(MX)-砂仁(SR)药对潜在作用靶点和功能性消化不良(Disease)的相关靶点进行匹配映射，最终得到37个交集靶点，制成韦恩图(图1)。

图1 木香-砂仁药对与疾病靶点交集韦恩图

2.3 蛋白互作网络的构建及分析

将药物疾病交集的37个靶点信息输入到string数据库中进行分析，剔除掉在网络中的孤立靶点，最终纳入34个蛋白，并获得它们的相互作用关系，利用Cytoscape软件绘制蛋白互作网络图(图2)。图中共涉及节点34个，边115条。节点的大小代表degree值，节点越大，degree越大。其中度值排名前15的蛋白为NR3C1、PTGS2、EGFR、DRD2、ESR1、AR、SLC6A4、CYP19A1、PIK3CA、DRD4、ACHE、CNR1、F2、MAOA、GABRB2，表明这些蛋白在网络中的地位重要。

图2 交集靶点的蛋白互作网络

2.4 “药物-活性成分-作用靶点”网络构建与分析

将两味药物、活性成分、作用靶点导入Cytoscape软件，构建“药物-活性成分-作用靶点”网络(图3)。该图有148个节点，包括活性成分111个，靶点34个，以及538条边。从图中可看到木香-砂仁药对中存在不同化合物作用于同一靶点的现象，这体现了中药多成分多靶点之间协同作用的机制。网络中节点的大小表示度值，由图可知，度值排名前15位的靶点分别是CYP19A1、AR、PTGS2、ACHE、CYP17A1、F2、ESR1、SLC6A4、DRD2、ESR2、EGFR、SLC6A2、NR3C2、HMOX1、FLT3，为网络中的关键节点。作用于上述部分靶点的成分，在网络中也有较高的度值，如quercetin(槲皮素)、Ambrosin(豚草素)、Stigmasterol(豆甾醇)、Santamarine(裂叶苣荚莱内酯)等，其中，豆甾醇是木香、砂仁的共同成分。以上说明这些靶点和成分可能在木香-砂仁药对治疗FD的过程中发挥了重要的作用。

图中节点大小代表degree值，degree值越大，节点越大。其中，蓝色圆形节点表示靶点，棕色方形节点表示木香化合物，绿色菱形节点表示砂仁化合物，黄色四边形节点表示木香砂仁共同的化合物，浅绿色三角形表示砂仁，橙色三角形表示木香。

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

通过R软件进行功能富集分析，并将生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)各取P值最小的前十条结果绘制柱状图(图4)。

图4 交集靶点的GO分析柱状图

KEGG通路富集分析结果，并将P值排名最小的20条通路可视化(图5)。其中涉及到神经活性配体-受体相互作用、泌乳素信号通路、尼古丁成瘾、5-羟色胺能突触、GABA能突触、吗啡成瘾、可卡因成瘾、多巴胺能突触、内分泌抵抗、卵巢类固醇生成、雌激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等信号通路。木香-砂仁药对很可能通过这些通路对功能性消化不良发挥作用。

图5 交集靶点KEGG富集分析的前20条通路

2.6 活性成分-靶蛋白分子对接分析

一般认为，配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。根据网络图拓扑值结果，将槲皮素(PubChem CID：5280343)、豚草素(PubChem CID：92119)、豆甾醇(PubChem CID：5280794)、裂叶苣荚莱内酯(PubChem CID：188297)这4个成分和ACHE(PDBID：4EY5)、CYP19A1(PDBID：5JKW)、EGFR(PDBID：2RGP)、PTGS2(PDBID：5KIR)、DRD2(PDBID：6CM4)、ESR1(PDBID：1ERR)、ESR2(PDBID：1X7B)、NR3C1(PDBID：6EL6)这8个靶蛋白进行分子对接。结果发现，这4种化合物与8个靶蛋白的结合能均<0 kcal·mol-1，说明活性成分化合物与筛选出来的靶点发生作用的可能性较大，验证了预测结果的可靠性，见表1。最后，将每个蛋白质与化合物对接分数最佳的结合方式用PYMOL进行展示，见图6。

表1 木香-砂仁药对活性化合物与部分靶点分子对接的结合能 kcal·mol-1

A：ACHE与槲皮素结合方式；B：CYP19A1与豆甾醇结合方式；C：EGFR与豆甾醇结合方式；D：PTGS2与槲皮素结合方式；E：DRD2与豆甾醇结合方式；F：ESR1与槲皮素结合方式；G：ESR2与裂叶苣荚莱内酯结合方式；H：NR3C1与槲皮素结合方式。

3 讨论

近年来越来越多的研究认为FD是一种身心疾病，FD患者常合并焦虑、抑郁情绪，可见精神、心理因素在FD的发生发展及转归中具有重要作用[13]。中医认为，本病的发病部位在胃，与肝脾密切相关，肝郁和脾虚是发病的关键病机，在治疗方面，当以疏肝健脾理气为法，木香砂仁两药合用，共奏疏肝健脾、行气宽中、温中止痛之效。

根据“药物-活性成分-作用靶点”网络、PPI网络及分子对接结果，发现NR3C1、PTGS2、ACHE、ESR1、ESR2、CYP19A1等在网络中具有重要的地位，推测木香-砂仁药对可能通过这些靶点起到治疗FD的作用。下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)作为神经内分泌免疫网络的枢纽，在中枢神经系统对胃肠道运动功能的调控中意义重大，其不仅能维持人体内环境的稳定，还能对外界环境的刺激作出应答，在应激中发挥着重要作用[14]。有研究[15]发现，应激可引起HPA轴的活动异常，导致胃内蛋白酶及激素等分泌紊乱，进而诱发消化系统炎性反应、免疫应答以及肠神经系统重塑，使内脏处于高动力状态，这是患者产生长时间疼痛等不适症状的原因之一。NR3C1是糖皮质激素受体，主要参与应激时诱导的肾上腺分泌糖皮质激素的HPA轴的负反馈调节。据报道[16]，当患者处于长期抑郁或其他慢性应激状态时，下丘脑及垂体NR3C1表达下降，导致HPA轴的负反馈机制失调，从而影响胃肠运动。因此推测木香-砂仁药对可能通过影响NR3C1，调节糖皮质激素分泌，调控HPA轴进而发挥治疗FD的作用。此外，有研究[17-18]发现，FD患者的胃十二指肠黏膜存在多种炎性细胞浸润，与黏膜屏障功能受损相关。VANORMELINGEN等[19]通过动物实验发现，存在胃肠道黏膜炎症反应的大鼠，其胃底肌肉松弛能力减弱，胃容受性功能受损，这提示炎症与FD的发病机制有重要关联。PTSG2(COX2)是一种在细胞内外刺激作用下激活，参与组织炎症过程及细胞的分化增殖过程的诱导酶，抑制PTGS2的活性可以减少前列腺素E2的生成，进而起到抗炎作用[20]。ESR1、ESR2是雌激素受体的2个亚型，存在于大多数组织中，并且在胃底胃窦以及十二指肠等消化系统组织、免疫系统的细胞中也可以被检测到，这提示ESR1、ESR2可能具有潜在的调节胃肠道的功能的效果[21]。有研究[22]发现，在胃肠道炎症性疾病中，ESR1、ESR2受体具有几乎相同的DNA结合域，都通过与相同的内质网反应元件结合激活转录，并且都能拮抗NF-κB功能活性，进而发挥抗炎作用。CYP19A1是雄激素转化为雌激素的关键限速酶，会直接影响人体内雌激素的水平，而雌激素可以通过作用于神经内分泌细胞和胃肠神经显著抑制胃排空，改变胃动力及节律，还可抑制胃酸分泌[23]。但目前国内尚未有研究提示CYP19A1与FD之间存在直接关联，这可能可以成为未来的研究方向。乙酰胆碱(ACH)是一种存在于胃肠道兴奋神经元中的胃肠动力兴奋性递质，可以促进胃及十二指肠运动、加速胃排空，对胃肠平滑肌的收缩起着重要作用。ACH从突触前神经元释放到突触间隙，与乙酰胆碱受体结合，影响胃运动或被乙酰胆碱酯酶(ACHE)灭活，现代西医治疗FD胃肠运动障碍使用的药物如依托必利、新斯的明等就是乙酰胆碱酯酶抑制剂，这说明胃动力可以通过抑制ACHE活性来调节[24]。因此本研究推测，木香-砂仁药对可能通过作用于ACHE、ESR1、ESR2等靶点，通过调节胃肠道的运动改善FD的症状进而发挥治疗作用。

GO分析结果提示，大多数靶点富集到的重要生物学过程主要涉及对激素刺激的反应、神经系统过程等，总体而言，基因本体分析得到的生物学过程条目与炎症、免疫以及神经递质水平调节有密切联系。通过对靶点的KEGG通路富集发现，前20条通路与神经调节、免疫炎症、内分泌调节等相关。其中，内分泌抵抗、雌激素信号通路值得引起关注，通过上文可知雌激素会影响胃肠功能，流行病学报告显示，女性在FD方面有更高的患病率[2]。孕产妇以及围绝经期女性因体内雌激素水平波动较大，较容易出现功能性消化不良的临床症状，这更加说明雌激素与FD之间存在联系。此外，雌激素可调节多种神经递质如5-羟色胺(5-HT)等，而且与抑郁情绪、情感障碍之间也有复杂的关联，而抑郁情绪可以通过脑肠肽等神经递质影响植物神经系统功能，不仅导致消化液的分泌异常，还会干扰消化系统的动力[23]。这也进一步提示，木香-砂仁药对可能通过作用于雌激素信号通路及内分泌抵抗信号通路发挥治疗FD的作用。通路富集结果中的5-羟色胺能突触、GABA能突触、神经活性配体-受体相互作用、尼古丁成瘾等通路与抑郁障碍密切相关，而FD患者经常合并有精神心理异常，抑郁情绪、应激状态等又会反向加重临床症状[25]。由此推测木香-砂仁药对可能通过作用于以上通路，改善患者的情绪及精神状态，起到治疗FD的效果。

本研究通过网络药理学和分子对接技术对木香-砂仁药对治疗FD的潜在物质基础和分子机制、作用通路进行了探讨，体现了其多成分、多靶点、多途径治疗的特点，为进一步深入探究木香-砂仁药对的药理作用机制提供了新思路，但其结果仍需后续的基础研究进行验证。