妊娠对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的免疫调节作用

张洪连，周鑫华，谢 琛，江建香，梅竹君，刘诗英，胡 凡，曹文锋

(江西省人民医院、南昌大学附属人民医院神经内科,南昌 330006)

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种免疫介导的具有遗传易感性的中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘性疾病，具有时间多发、症状多发及空间多发的临床特点。流行病学显示MS发病率存在性别差异，全世界男女比例大约为1：2，青春期该比例增至1：4，导致这种性别差异的原因可能为基因易感性、免疫反应性别差异及体内性激素差异等[1]。MS发病高峰期为20～40岁，目前国外学者开展了一些回顾性及前瞻性的临床研究发现妊娠期MS患者的病情进展及复发情况与非妊娠期比较存在差异，但这种差异在不同临床试验的研究结论中存在不一致性[2-4]，故至今妊娠对MS疾病的影响还不明确。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是模拟人类MS的经典动物模型，病理基础都是主要活化CD4+T细胞参与免疫损伤的[5]。因此，本文拟研究妊娠后EAE小鼠的神经功能缺失及体内免疫系统的变化情况，为临床上探究妊娠对女性MS患者疾病影响提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

完全弗氏佐剂FCA(上海源叶生物科技有限公司)；不完全弗氏佐剂FICA(美国Sigma公司)；Pertussis toxin(百日咳毒素)(美国List labs公司)、MOG35-55(生工生物工程(上海)股份有限公司)；荧光标记的细胞表面单克隆抗体FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3(美国Biolegend公司)；小鼠IFN-γ、IL-17、IL-10的ELISA检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，苏木素染液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；伊红染色液(北京Solarbio公司)，Scott蓝化液(北京Solarbio公司)，焦油紫(美国New Jersey公司)，Luxol fast blue(美国Sigma公司)，高清晰度彩色医学图像分析系统(武汉千屏影像技术有限责任公司)，光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 实验动物

C57BL/6J鼠30只，雌性，6～8周龄(湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2009-0004)；C57BL/6J鼠10只，雄性，3月龄(上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，许可证号：SCXK(沪)2018-0006)。饲养条件：温度20～26 ℃，湿度40%～70%。SPF级繁殖饲料饲养。

1.3 EAE小鼠模型的制作

雌性小鼠适应性培养1周后，于背部两侧皮下注射诱导EAE的抗原乳剂，0.2 mL·只-1，MOG35-55多肽剂量为300 μg·只-1。最后腹腔注射百日咳毒素，300 ng·只-1；48 h后再次腹腔注射百日咳毒素400 ng·只-1。建模成功雌性EAE小鼠30只。

1.4 实验分组

注射完第2针百日咳毒素后第11天雌雄小鼠按2:1比例合笼受孕，次日检查是否形成阴道栓来评估是否受孕，见栓日定为妊娠第1天。以成功妊娠的小鼠为妊娠组(n=10)；未配孕的小鼠为对照组(n=10)。若妊娠组小鼠死亡，则重新选取雌鼠建模、受孕。

1.5 神经功能评分

采用5分评分法对妊娠后EAE小鼠进行神经功能评分，评分时间点为妊娠后第1、4、7、10、13天(即建模后第12、15、18、21、24天)。评分细则为:0分，无症状；1分，轻度步态笨拙或尾部张力降低；2分，中度姿态异常或姿态维持缺乏或尾部无张力;3分，肢体乏力；4分，肢体无力；5分，濒死状态或死亡。

1.6 ELISA法检测

妊娠后第13天(妊中期)的EAE小鼠，摘除眼球收集血液，分离提取血清，按照ELISA试剂操作步骤检测IFN-γ、IL-17、IL-10浓度，结果以ng·mL-1表示。

1.7 HE染色及Bielshowsky’s-Luxol fast blue staining双染

采用脱臼法将妊娠第13天EAE小鼠处死，取脑和脊髓固定，包埋蜡块，制作成切片，再将切片常规脱蜡并水化后，进行HE染色及Bielshowsky’s-Luxol fast blue staining双染，分别观察脑和脊髓病灶区炎症细胞的浸润及神经纤维脱髓鞘情况。

HE染色切片半定量评估方法如下：未见或偶见炎症细胞浸润为0分；仅血管周围和脊髓膜有炎症细胞浸润为1分；脑或脊髓内有少量炎症细胞浸润为2分；脑或脊髓内中量炎症细胞浸润为3分；脑或脊髓内大量炎症细胞浸润为4分。

1.8 流式细胞术

采用流式细胞术检测脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比。分离出EAE小鼠脾脏，研磨提取出淋巴细胞，反复洗涤干净后收集淋巴细胞，加入FITC标记的CD4抗体和APC标记的CD25抗体，孵育60 min后将细胞重悬，并加入固定和通透液，孵育30 min后加入PE标记的Foxp3抗体，继续孵育30min，洗涤上机检测。用CD4+细胞进行门控，检测CD25+Foxp3+Treg细胞百分比。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 神经功能评分比较

EAE小鼠大约在免疫后第11天开始出现症状，首要症状主要为尾部张力下降，症状逐渐加重，出现步态不稳、肢体无力等。如图1所示，妊娠前2组间的神经功能评分比较无差异，但随着发病时间延长，虽然两组的EAE小鼠神经功能评分均呈进行性增加，但妊娠组与对照组比较更低，且在妊娠后第10、13天差异有统计学意义(P<0.05)。

妊娠后时间/d

2.2 血清IFN-γ、IL-17、IL-10水平

妊娠组EAE小鼠血清中IL-10水平为(56.89±7.45)ng·mL-1，高于对照组的(43.78±6.95)ng·mL-1(P<0.05)；IL-17水平[(455.42±23.81)ng·mL-1]与对照组[(516.22±24.76)ng·mL-1]比较显著降低(P<0.05)；且IFN-γ水平[(920.12±45.65)ng·mL-1]与对照组[(1073.67±71.23)ng·mL-1]比较也显著降低(P<0.05)，见图2。

*P<0.05。

2.3 炎症细胞的浸润情况

妊娠组和对照组的EAE小鼠脊髓实质内都有少到中量的炎症细胞浸润，并可见血管周围呈袖套样炎症细胞浸润(图3A—B)，且妊娠组脊髓病灶区炎症细胞半定量得分为(2.33±0.24)分，低于对照组的(3.21±0.47)分(P<0.05)，见图4。

A：妊娠组；B对照组。箭头所示为袖套样炎症细胞。

2.4 神经纤维脱髓鞘情况

将脑和脊髓组织切片采用双染方法染色后髓鞘染成蓝色，轴索染成黑色；且妊娠组和对照组EAE小鼠的脑和脊髓白质内均可见神经脱髓鞘改变，但妊娠组的脱髓鞘程度较对照组轻，见图5。

A：妊娠组；B：对照组。箭头所示为神经脱髓鞘。

2.5 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数百分比

妊娠组EAE小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数百分比为(9.63±0.47)%，高于对照组的(5.73±0.39)%(P<0.05)，见图6。

图6 2组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数百分比比较

3 讨论

妊娠是育龄期女性最重要的任务之一，但作为MS的高发人群，处于妊娠期时MS女性患者其临床症状如何变化目前仍不明确。RUOLLET等[2]在1993年首次针对这个问题进行了研究，未发现妊娠期复发率减低，但分娩后3个月内复发率比妊娠前升高了3倍，同时发现有过妊娠史的MS患者总体复发率低于无妊娠史者。CONFAVREUX等[3]分析MS患者妊娠前1年、妊娠期、分娩后1年的复发情况，发现MS患者怀孕期复发风险下降，尤其是孕晚期，但分娩后3个月内复发率显著增加，然后逐渐恢复怀孕前状态。FARES等[4]的试验结果显示在怀孕期和分娩后第1年MS无复发，但分娩后第2年复发率稍增加，第3年后复发率回归于普通MS患者。根据目前临床试验结果提示妊娠时MS女性患者的复发率呈降低趋势，并且还存在妊娠早、中晚期及分娩后的差异。同时有少量国外学者采用EAE小鼠模型进行了相关动物实验研究，GEIKO等[6]发现妊娠期EAE大鼠模型其神经功能缺失评分明显低于对照组。GATSON等[7]研究发现妊娠期的EAE小鼠模型通过低表达TNF-a、IL-17等炎性因子减轻中枢神经系统炎症反应继而使其神经功能缓解。本实验同样研究发现妊娠中期(妊娠周期为20～21 d，第13天处于妊娠中期)EAE小鼠的神经功能缺失症状与对照组比较减轻。结合目前临床和动物实验结果提示妊娠期MS/EAE的复发率呈下降趋势，临床症状相对较轻。

MS妊娠期复发率下降及临床症状相对缓解的作用机制目前仍不确定。目前研究发现可能机制为妊娠期母体激素包括雌激素、孕激素及雄激素大量合成后具有免疫调节和神经保护作用[8-11]。MS是主要以CD4+Th1参与的细胞免疫为主的自身免疫性疾病，研究发现妊娠期母体高浓度雌激素能促使Th1型细胞免疫体系向Th2型体液免疫的明显偏倚，继而抑制促炎性Th1/Th17细胞的活化，从而下调MS患者Th1介导的慢性炎症级联反应，减轻中枢神经脱髓鞘和神经退行性改变[12]，本研究采用组织学染色同样发现妊娠期EAE小鼠脊髓实质的脱髓鞘病理变化较对照组减弱。

调节性T细胞(Treg细胞)通过抑制机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而维持机体的免疫耐受[13]。Treg细胞能调节Th1、Th2及Th17免疫细胞的整体平衡，从而降低IFN-γ和IL-17等促炎性细胞因子的分泌，缓解MS/EAE临床症状[14]。同时激活的Treg细胞可分泌IL-35和IL-10等抗炎性细胞因子，具有免疫抑制功能，继而调节免疫反应和避免免疫反应过度，故Treg细胞数量升高有利于自身免疫性疾病的病情缓解[9,15]。本实验发现与对照组比较，妊娠期EAE小鼠脾脏内CD4+CD25+Treg细胞数百分比显著增多，且血清中促炎性因子IFN-γ、IL-17降低和抗炎性细胞因子IL-10升高，而且采用HE染色进一步发现妊娠EAE小鼠脊髓实质内炎症细胞浸润程度减弱。因此，妊娠期MS/EAE的免疫系统可能通过分化和激活更多的Treg细胞来发挥其免疫调节和神经保护作用。

综上所述，妊娠期EAE的临床症状改善、中枢神经系统的炎症反应和脱髓鞘程度减轻；其可能的作用机制为增加机体分化更多的Treg细胞，并提高其分泌抗炎性细胞因子IL-10的能力，同时抑制促炎性细胞因子IFN-γ、IL-17的分泌。本实验结果为后期研究提供一定的动物实验依据。