5-羟色胺通过5-羟色胺2A受体对肺动脉成纤维细胞的激活作用

韩新源,王顺达,雍志军,张雪婷,王暄齐,杨俊生

(陕西省人民医院康复医学科,西安 710068;*通讯作者,E-mail:hanxinyuan0408@163.com)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一种由多种原因造成的临床及病理生理综合征,以肺血管阻力增加和肺动脉压力升高为特征,严重者可发展成右心衰竭甚至死亡[1]。肺血管重构造成的肺血管结构或功能改变是肺动脉高压最重要的发病机制[2]。研究发现,肺血管重构的一个根本问题是肺血管外膜成纤维细胞(pulmonary artery adventitial fibroblasts,PAFs)的持续激活,表现为PAFs增殖、分化、分泌和代谢异常[3]。而目前PAH的治疗方法并没有直接针对此问题,因此,如何抑制PAFs的异常活化是控制PAH肺血管重构的关键问题。

5-羟色胺(serotonin,5-hydroxytryptamine,5-HT)是一种血管活性物质,既往的研究发现5-HT是参与PAH形成和发展的重要分子[4]。5-HT通过与细胞膜上的受体和转运体结合而发挥作用,目前发现的5-HT受体可以分为7个家族,其中5-HT2A受体已被证明与PAH的发生相关[5-7]。本课题组既往的研究结果显示,5-HT2A受体阻滞剂盐酸沙格雷酯能够降低野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉压,减轻肺动脉纤维化、改善肺动脉重构[8]。本研究在细胞水平观察5-HT2A受体对5-HT诱导的肺动脉外膜成纤维细胞激活及血管外间质异常沉积的影响,为肺动脉高压的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

5-HT购于英国Tocris公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜、5-HT2A受体拮抗剂Ketanserin(S006)、5-HT2A受体激动剂1-(2,5-二甲氧基-4-碘苯基)-2-氨基丙烷盐酸盐(1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane,DOI)购自美国Sigma公司;Transwell迁移小室购自美国Corning公司;α-SMA兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Abcam公司;Fn小鼠抗大鼠单克隆抗体、Col-Ⅰ兔抗大鼠多克隆抗体、CTGF羊抗大鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 大鼠原代肺动脉成纤维细胞的分离与培养

参照Welsh等[9]的血管成纤维细胞分离方法,分离原代肺动脉成纤维细胞。当细胞生长到融合铺满培养瓶底80%时,加入0.25%的胰蛋白酶消化传代接种到培养瓶中,传代培养时使用DMEM培养基,置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养,保持细胞形态稳定。随后的实验使用第3代对数期生长的细胞。

1.3 细胞分组及处理方法

无血清培养基培养24 h后,将PAFs随机分为4组:对照组、5-HT组、5-HT+Ketanserin组、DOI组。对照组不做处理,5-HT组加入浓度为10-6mol/L的5-HT,5-HT+Ketanserin组加入浓度为10-6mol/L的5-HT和10-6mol/L Ketanserin,其中Ketanserin在5-HT加入前30 min加入细胞培养液;DOI组加入浓度为10-6mol/L的DOI,37 ℃、5%CO2的培养箱培养24 h。

1.4 MTT法检测PAFs增殖

在96孔板中培养PAFs,待细胞单层铺满孔底,细胞于无血清的DMEM培养液中孵育24 h,每组设立5个复孔;按照1.3分组处理PAFs,细胞干预完成后,去除培养液,使用PBS将每孔细胞洗2次;每孔加入200 μl培养液和0.5%MTT 20 μl,继续培养4 h;终止培养,吸弃培养液,每孔加入150 μl二甲基亚砜,置摇床上避光低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值,每组5孔吸光值平均后作为该组单次实验结果。实验重复3次。

1.5 Transwell法检测PAFs迁移

按照1.3分组处理PAFs,用无血清的培养基重悬并计数细胞,调整细胞密度至1×105/ml,取细胞悬液100 μl加入Transwell小室,5% CO2,37 ℃培养24 h。取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。用无菌的PBS洗3次,无水乙醇固定30 min,将小室适当风干。室温下,0.1%结晶紫染色30 min,用PBS洗涤后,200倍显微镜下随机取不同视野观察细胞,统计每个视野中的迁移细胞数并计算平均值并拍照。

1.6 Western blot检测蛋白水平

按照1.3分组处理PAFs,待细胞干预完成后,提取蛋白并进行蛋白浓度测定及蛋白变性。10%聚丙烯酰氨凝胶电泳,转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h。分别加入α-SMA(1 ∶500)、CTGF(1 ∶200)、Col-Ⅰ(1 ∶200)、Fn(1 ∶200)抗体和GAPDH抗体(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜,二抗室温孵育1 h,TBST洗膜,电化学发光试剂(Bio-Rad)暗室显影。Quantity one软件分析目的蛋白与内参GAPDH蛋白灰度值,计算相对灰度值。

1.7 数据统计分析

2 结果

2.1 各组PAFs细胞增殖情况

MTT结果显示,与对照组相比,5-HT组PAFs细胞OD值显著升高(0.70±0.03vs0.96±0.02,P<0.01);与5-HT组相比,5-HT+Ketanserin组PAFs细胞OD值显著降低(0.96±0.02vs0.75±0.04,P<0.01);与对照组相比,DOI组PAFs细胞OD值显著升高(0.70±0.03vs0.82±0.03,P<0.05,见图1)。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与5-HT组比较,##P<0.01图1 5-HT及5-HT2A受体拮抗剂、5-HT2A受体激动剂对PAFs细胞增殖的影响Figure 1 Effect of 5-HT and 5-HT2A receptor antagonist,5-HT2A receptor agonist on proliferation of PAFs

2.2 各组PAFs细胞迁移情况

与对照组相比,5-HT组PAFs细胞迁移细胞数显著增加(P<0.01);与5-HT组相比,5-HT+Ketanserin组PAFs细胞迁移细胞数显著减少(P<0.01);与对照组相比,DOI组PAFs细胞迁移细胞数显著增加(P<0.01,见图2)。

图2 5-HT及5-HT2A受体拮抗剂、5-HT2A受体激动剂对PAFs细胞迁移的影响 (×200)Figure 2 Effect of 5-HT and 5-HT2A receptor antagonist,5-HT2A receptor agonist on migration of PAFs (×200)

2.3 各组PAFs细胞中α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表达情况

与对照组相比,5-HT组PAFs细胞α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);与5-HT组相比,5-HT+Ketanserin组PAFs细胞α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与对照组相比,DOI组PAFs细胞α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表达水平显著升高(P<0.01,见图3)。

3 讨论

肺血管重构是PAH的特征性病理改变和病情难以逆转的重要因素。在肺血管重构的过程中,肺动脉壁的三层血管结构即内膜、中膜和外膜均发生改变,其中,外膜在血管功能和结构的调节中起着关键作用[10]。在PAH血管重构的过程中,PAFs作为血管外膜最主要的细胞类型能被多种途径激活,进而出现过度增殖、抗凋亡、促炎和代谢异常等表型[3]。此外,在一些血管活性物质和细胞因子的作用下,活化的PAFs可转化为肌成纤维细胞,肌成纤维细胞能表达α-SMA等收缩相关的骨架蛋白而具备收缩力,可迁移至中膜甚至内膜促进血管壁增厚。肌成纤维细胞还可以分泌收缩分子、细胞外基质(ECM)、生长因子等,从而在PAH肺血管增殖性重构中起重要作用[11-13]。

5-HT作为调节细胞增殖和迁移过程的众多血管活性物质之一,是参与PAH形成和发展的重要分子。既往研究发现,5-HT能够促进肾小球系膜细胞的增殖并激活纤维化信号通路,还能激活心肌成纤维细胞并诱导其增殖和迁移[14,15]。本课题组以往的研究表明5-HT可促进肺动脉平滑肌细胞增殖[16]。

与对照组比较,**P<0.01;与5-HT组比较,##P<0.01图3 5-HT及5-HT2A受体拮抗剂、5-HT2A受体激动剂对PAFs细胞中α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表达的影响Figure 3 Effect of 5-HT and 5-HT2A receptor antagonist,5-HT2A receptor agonist on the expression of α-SMA, CTGF, Col-Ⅰ and Fn protein in PAFs

本研究使用5-HT处理PAFs显示细胞的OD值、迁移细胞数显著升高,提示5-HT可以促进PAFs的增殖和迁移。此外,5-HT干预的PAFs,α-SMA蛋白的表达显著增加,提示5-HT刺激PAFs发生了表型转化。CTGF是一种属于CCN家族的细胞因子,具有促进成纤维细胞分裂、增殖、分化、迁移和合成细胞外基质等多种功能[17],并被证实参与多种组织器官的纤维化过程。纤连蛋白(Fn)、胶原是ECM的主要构成组分,其表达增多会影响血管结构和功能,成为血管重构的重要原因。在PAH血管重构中,外膜ECM中胶原蛋白、纤连蛋白和肌腱蛋白C等显著增加[18]。本研究结果显示,与对照组相比,5-HT干预的PAFs中CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表达水平均显著升高,提示5-HT可增加促纤维化因子生成,促进ECM成分的分泌合成,增加ECM重塑。

5-HT2A受体是一种G蛋白偶联受体,5-HT与其结合后可以激活细胞内一系列的信号通路,调节细胞的生理活性。既往认为,5-HT2A受体主要通过促进肺动脉收缩参与PAH。但也有研究显示,5-HT2A受体拮抗剂可以预防MCT诱导的肺动脉压力升高和肺血管结构重构,提示5-HT2A受体除了促进肺动脉收缩外,还参与了PAH肺动脉重构[19]。本课题组既往动物实验也证实了这一点[8]。而本研究进一步在细胞水平上证实5-HT2A受体参与肺血管重构。本研究观察到,5-HT2A受体激动剂能够模仿5-HT的作用促进PAFs的增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成,而5-HT2A受体拮抗剂则可以抑制5-HT诱导的PAFs增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成,提示5-HT2A受体参与了5-HT对PAFs的激活作用。在5-HT与大鼠血管平滑肌细胞关系的研究中,给予5-HT2A受体阻断剂后,肺动脉平滑肌细胞的增殖受到抑制,且抑制程度与5-HT2A受体阻断剂的水平密切相关,呈剂量依赖性[20]。我们课题组前期研究也证实,5-HT2A受体激动剂抑制PASMCs凋亡,5-HT2A受体拮抗剂还可以预防5-HT诱导的PASMCs凋亡减少,提示5-HT2A受体还参与了5-HT抑制PASMCs凋亡[7]。

综上所述,5-HT2A受体参与了5-HT对肺动脉成纤维细胞增殖、迁移的促进作用及对PAFs的激活作用。该结果进一步揭示了5-HT及5-HT2A受体在PAH发生中的作用,也为PAH治疗提供了新的治疗靶点和方向。