加减益经汤对DOR模型大鼠的实验研究

★ 万云慧 万云云 陶莉莉 陈晓勇（.江西省妇幼保健院中医科 南昌 0006；.南昌县人民医院产科 南昌 000；.广州中医药大学第一附属医院妇科 广州 50405）

卵巢的功能包括：产生并排出卵子和分泌女性性激素［1］。卵巢的这两大功能下降则称为卵巢功能低下（diminished ovarian reserve，DOR)，临床表现为<40岁的女性出现低的生育力及一系列女性性激素缺乏的临床表现。近来，DOR的发病年龄越来越年轻化，发病率逐年上升，但其发病机制尚未明确，因此治疗上也给临床医生带来了极大的挑战。日前现代医学主要采用激素人工周期治疗，但其治疗的副作用及某些疾病限制了其使用。既往的临床研究结果显示加减益经汤能够改善DOR患者的卵巢功能，但其治疗机制尚不明确。因此本研究将从实验动物研究方面来阐述加减益经汤治疗DOR的作用机理，以期为加减益经汤临床治疗DOR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 本实验中药加减益经汤药物的主要成分如下：熟地 20 g，菟丝子 20 g，当归 10 g，白芍 10 g，丹参 15 g，党参 20 g，柴胡 6 g共 9 味。将这些药物煎煮浓缩为每毫升含生药1.18 g的药液。补佳乐：每片含戊酸雌二醇1 mg。由拜尔医药保健有限公司生产。批准文号：国药准字J20130009。

1.3 实验分组方法 将这些SD雌性大鼠适应性地喂养7 d后，选出动情周期为4～5 d的大鼠共120只，随机分成4组，每组30只：空白组、模型组、中药组、西药组。

1.4 大鼠卵巢功能损害模型的建立 空白组大鼠给予0.9 %生理盐水共1 mL腹腔单次注射，剩下的3组大鼠给予环磷酰胺（CTX）75 mg·kg-1单次腹腔注射。每组的大鼠都每天在相同的时间取其阴道分泌物涂片以观察其动情周期。

1.5 饲养及给药方法 各组大鼠均提案按基础饲料饲养、自由喝水。腹腔注射2 h后开始给各组大鼠灌胃，空白组和模型组：均给予2 mL的0.9 %生理盐水灌胃；中药组：加减益经汤临床日用量131 g生药，参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量，采用中剂量，即大鼠予11.8 g·kg-1生药灌胃；西药组：临床补佳乐常规日用量1 mg，参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量，予0.09 mg·kg-1补佳乐灌胃。每组均1天1次，共连续灌胃4周。

1.6 检测指标 每组于灌胃给药后的第4、6、8周，分别处死10只在动情间期的SD雌性大鼠。

（1）大鼠的基本情况：各周注意查看SD大鼠的皮毛、饮食、精神及大鼠体重变化情况。

（2）大鼠的动情周期：开始灌胃后，每天给予大鼠的阴道脱落细胞涂片，经过苏木素伊红染色后，观察大鼠的动情周期变化。

（3）血清激素的检测：所有的SD大鼠经眼眶后静脉丛或股静脉采血，采用酶联免疫吸附技术（ELISA）检测各组SD大鼠血清中的AMH，INHB，ACTA，FS的水平。

1.7 统计学处理 实验所得资料输入电子计算机，应用软件 SPSS 17.0 for windows进行数据统计，分析所得的计量资料用均数±标准差（） 表示；均数比较前行方差齐性检,两样本均数的比较采用独立样本t检验, 自身前后对照的比较应用配对t检验。结果均以P<0.05为差异有统计学意义。

在大数据的背景下，教学环境也开始向信息化的方向发展。因此，对于高职院校而言，也应该积极地利用大数据的这一优势，建立相关的数学实验室，提高学生的数学实际操作能力。对于学生来说，信息化数学实验室的建立不仅能力吸引到他们的学习兴趣，也能够提高实际的数学学习效果，培养他们的数学应用能力。

2 结果

2.1 大鼠的基本情况 灌胃用药的过程中,各组的SD大鼠全部都存活。经CTX腹腔注射造模后的各组SD大鼠全部出现了精神萎靡、行动困难、呼吸短促、反应迟钝、活动次数减少、四肢乏力、摄水和摄食量明显减少，被毛稀松、蜷缩弓背、无光泽，小便清长、大便溏薄等症状，解剖SD雌性大鼠均出现内脏淤血的情况。各给药组在治疗6周后以上各项一般情况基本恢复正常，与空白组大鼠比较无明显差异（P>0.05）。

2.2 大鼠的动情周期

2.2.1 空白组 空白组的SD雌性大鼠阴道涂片显示均有相对比较规则的动情周期变化，周期为4～5 d，动情间期为 1.5～2.5 d。

2.2.2 模型对照组 CTX造模后第4周，模型组的SD雌性大鼠在阴道涂片显示已无规则的动情周期，动情周期延长至7～16 d不等。阴道涂片结果显示分泌物量少，散在的白细胞较多，少量的上皮细胞，偶有少量的有核细胞和角化细胞，动情间期时间为5～7 d。

2.2.3 治疗组 中药组和西药组第4、6、8周后恢复至正常的动情周期。

2.3 对大鼠血清激素水平的影响

2.3.1 对DOR大鼠血清AMH水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中AMH的水平在第4、6、8周均下降，差异有统计学意义（P<0.01），说明DOR大鼠模型造模成功。与模型组比较，中药组和西药组SD雌性大鼠血清AMH水平在第4、6、8周均升高，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。见表1。

表1 大鼠血清AMH的变化（ ，n=10）

2.3.2 对DOR大鼠血清INHB水平的影响 与空白组比，较模型组的SD雌性大鼠血清INHB的水平在造模后第4、6、8周均下降，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，中药组和西药组SD雌性大鼠血清INHB的水平升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与空白组比较，中药组SD雌性大鼠血清INHB的水平在第8周恢复正常水平（P>0.05）。见表2。

表2 大鼠血清INHB的变化（ ，n=10）

2.3.3 对大鼠血清ACTA水平的影响 与空白组比较，模型组的SD雌性大鼠血清ACTA的水平在第4、6、8周均升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，中药组SD雌性大鼠血清ACTA在第4、6、8周均下降（P<0.05或P<0.01）。与空白组比较，中药组SD雌性大鼠血清ACTA在第4周恢复至正常水（P>0.05），西药组大鼠血清ACTA在造模后第8周恢复至正常水平（P>0.05）。见表3。

表3 大鼠血清ACTA的变化（ ，n=10）

2.3.4 DOR大鼠血清FS水平的影响 与空白组比较，模型组SD雌性大鼠血清FS的水平在第4、6周均降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，中药组SD雌性大鼠血清FS水平在第4、6周升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与空白组比较，中药组和西药组SD雌性大鼠血清FS水平在第4周恢复正常水平（P>0.05）。见表4。

表4 大鼠血清FS的变化（ ，n=10）

3 讨论

INHB、ACTA和FS都为转化生长因子-β（TGF-β）超家族的成员，能够调节垂体及卵巢的内分泌功能，对于维持正常的女性生殖功能起到了重要的作用［2］。Veronica等［3］首次提出的 INHACT-FS这一系统。INHB是由卵巢窦卵泡中颗粒细胞分泌的一种糖蛋白激素，可以反馈性抑制 FSH的分泌情况，调节患者的生殖功能［4］。对于DOR患者来说，血清FSH水平升高，而血清INHB 水平降低［5-6］。ACTA也是由卵巢颗粒细胞分泌的，能够刺激垂体分泌FSH，提高FSH受体的表达，抑制LH刺激卵泡膜细胞分泌雄性激素的作用。ACTA广泛参与了卵泡发育、激素合成以及维持卵巢功能等过程，并发挥重要的调节作用［7］。FS主要是由垂体细胞、卵巢颗粒细胞分泌合成的，是ACTA的特异性结合蛋白，对卵泡的作用,与ACTA相反，可以抑制FSH的合成及分泌［8］。周卫琴等［9］的研究显示INH-ACT-FS系统的功能失调有可能会引起排卵障碍性不孕，INH-ACT-FS系统功能状态也可以直接用于卵巢储备功能的评估。国外学者显示，INH-ACT-FS系统的旁分泌行为能调控颗粒细胞和卵泡膜细胞的功能，该系统功能的异常，能够直接引起颗粒细胞和卵泡膜细胞功能的失常，进而影响卵母细胞的成熟，最终导致DOR、POF发生［10］。

AMH也是TGF-β超家族的成员之一，是由卵巢中的窦前卵泡和窦状卵泡的颗粒细胞分泌的一种蛋白激素，与女性的卵巢功能密切相关。AMH可以调控卵泡的初始募集、循环募集，而且能够抑制原始卵泡的消耗能［11］。AMH的水平在月经周期中变化不大，也不受外源性类固醇激素等药物因素及妊娠等生理变化的影响［12-13］。所以AMH可以作为评估卵巢储备功能的一个非常稳定的标志物。

加减益经汤是在傅青主创制的益经汤的基础上变化而来，其功效是：补肾健脾、疏肝活血、清养心肺。方中菟丝子、熟地益精填髓、滋补肝肾，柴胡、党参疏肝健脾；当归、丹参、白芍补血活血、养血柔肝、清养心肺。其中大部分药物在现代药理学上都具有抗衰老或调节内分泌的作用，该方在临床上运用多年，能够明显改善DOR患者的临床症状和卵巢功能。既往的临床研究已表明其能改善DOR患者的卵巢功能［14］。李丽美等［15］的研究证实加减益经汤可明显改善肾虚肝郁证 DOR 患者得卵巢功能，降低bFSH、bLH，升高bE2、AMH，增加AFC，副作用少。但对于加减益经汤治疗DOR的机理尚不明确，尚缺乏进一步的实验研究。

本实验研究结果显示经CTX造模后SD雌性大鼠出现了鼠血清AMH水平下降，说明CTX使大鼠的卵巢功能下降，和以往研究文献结果一致［16］；而且出现了血清INHB和FS水平下降，而血清ACTA水平的增加，说明CTX能使SD雌性大鼠INHB-ACTA-FS系统功能下降。而经加减益经汤治疗后，DOR模型大鼠血清AMH水平升高，说明加减益经汤可以升高DOR模型大鼠血清AMH的水平，再一次证实了加减益经汤能够改善卵巢功能。此实验结果显示加减益经汤可以升高大鼠血清INHB、FS水平，降低ACTA水平,表明加减益经汤能提高DOR模型大鼠INHB-ACTA-FS功能。由此推测，加减益经汤可能能够通过改善INHACT-FS功能来改善DOR患者的卵巢功能。

本研究从基础实验研究方面证实了加减益经汤治疗DOR的作用，揭示了加减益经汤能够通过改善INH-ACT-FS 系统功能来治疗DOR患者，为加减益经汤临床治疗DOR提供了一定的理论依据，推进了临床能够广泛应用加减益经汤治疗DOR。